ولا يمكن تحويل معظم خطوط الذرة الأصيلة وراثيا باستخدام بروتوكولات التحول التقليدية. هنا، نحن وصف طريقة تحويل QuickCorn التي هي سريعة وأقل تعتمد على النمط الجيني. طريقة QuickCorn يستخدم عوامل النسخ الذرة بوم وWUSCHEL.
عندما تدمج في نظام ناقلات التحول، تعمل هذه الجينات بشكل تآزري لتحفيز نمو الجنين. على عكس بروتوكولات تحويل الذرة التقليدية، لا تتضمن طريقة QuickCorn خطوة تحريضية أثناء التحول. تحتوي منطقة T-DNA للمتجه الثنائي المستخدم في عملنا على ثلاثة مكونات رئيسية، وهي جينات المورفوجين، ومورثات العلامات، ونظام إعادة التضمين.
وقد أُدرج نظام إعادة الدمج الناجم عن الحرارة في الحمض النووي T-DNA لإزالة الجينات المورفوجينية من جينوم الذرة للسماح بتجديد اللقاش الطبيعي في تطوير النباتات. حوالي يومين إلى ثلاثة أيام بعد ظهور الحرير وإذا حبوب اللقاح سوف تكون متاحة في اليوم التالي، وقطع الحرير وقشر مع 70٪ من الايثانول معقمة مقص، ما يقرب من 2 1/2 سم تحت نهاية أوراق قشر، حيث تظهر الحرير، وتغطي الحرير مع كيس تبادل لاطلاق النار. بمجرد خروج النشثر من شرابة ، غطي شرابة بحقيبة شرابة ، ووضع مقطع ورق غير زلق في قاعدة الحقيبة حول الساق.
في صباح اليوم التالي لوضع كيس شرابة، ثني بلطف النبات، والاستفادة من الحقيبة لتشجيع حبوب اللقاح ليتم الافراج عنهم. ثم إزالة كيس شرابة، وأضعاف الجزء العلوي من الحقيبة أكثر لمنع حبوب اللقاح من الهروب. لتللقي نبات المتلقي، وفضح الحرير، وصب حبوب اللقاح بسرعة من كيس شرابة على الحرير.
تغطية الأذن الملقحة على الفور مع كيس شرابة، وتأمين قاعدة من الحقيبة حول ساق مع المواد الغذائية. للتحقق من حجم الجنين غير الناضج ، بعد تسعة إلى 12 يومًا من التلقيح ، اسحب القشرة برفق لفضح حبات الأذن في حوالي 1/3 إلى 1/4 من محيط الأذن وحوالي 1/3 من المسافة أسفل الأذن. استخدم مشرطًا لشريحة قبعة نواة واحدة تظهر مشابهة لغالبية حبات أخرى في الحجم واللون، واستخدم ملعقة مع مسطرة لاستخراج الجنين.
ثم استخدم المسطرة أو الفرجار لقياس طول الجنين. في غضون يوم إلى أربعة أيام من الحصاد، وإزالة قشور والحرير من آذان حصادها، وإدراج مقبض مناسب في الجزء العلوي أو قاعدة كل أذن. غمر الأذنين في حاوية كبيرة من محلول تبييض التطهير في غطاء تدفق معقم مع مقبض تواجه ما يصل.
بعد 20 دقيقة، شطف الأذنين ثلاث مرات مع حجم سخي من الماء المقطر العقيمة الطازجة لمدة خمس دقائق لكل غسل قبل السماح للأذنين لتجف لعدة دقائق. بعد ذلك، قم بتعبئة أنبوب ميكروسنتر 2 ملليلتر لكل أذن مع 700A المتوسطة السائلة، واستخدام مشرط معقمة لإزالة أعلى واحد إلى ملليمترين من كل تاج نواة لفضح endosperm من الأذن. حدد مكان الجنين غير الناضج داخل النواة على الجانب الذي يواجه طرف الأذن، بالقرب من المرفق بالكوب.
بالنسبة للمعالج العلوي والمشغلين باليد اليمنى ، بقية الأذن على طبق بيتري معقمة كبيرة ، وإدراج ملعقة صغيرة في endosperm في أبعد من برحام الجنين. التواء بلطف إلى أعلى لإزاحة endosperm وفضح الجنين، واستخدام ملعقة لوضع بعناية الجنين في أنبوب واحد من 700A المتوسطة السائلة. بالنسبة لمشغلي معالج القاعدة الذين يمسكون الأذن باليد اليسرى، أدخل ملعقة صغيرة في إندوسبيرم في أبعد من الجنين، وقم بالالتفاف بلطف للأعلى لإزاحة إندوسبيرم.
لثقافة الأجنة في ثقافة تعليق Agrobacterium ، وجمع البكتيريا من لوحة عمل أعدت حديثا في 10 ملليلتر من 700A المتوسطة السائلة ، ودوامة لتعليق ثقافة البكتيريا تماما. قياس الكثافة البصرية في الطول الموجي من 550 نانومتر، وغسل الأجنة مع ملليلتر واحد من 700A المتوسطة الطازجة. اغمر الأجنة في ملليلتر واحد من تعليق Agrobacterium ، ودوة على إعداد منخفض لمدة 30 ثانية.
تسوية الأجنة على مقاعد البدلاء مع الأنابيب في اتجاه أفقي لمدة خمس دقائق قبل نقل محتويات كاملة من كل أنبوب على لوحات فردية من 562V المشتركة زراعة المتوسطة. دوامة بلطف لوحات لتوزيع الأجنة بالتساوي، وpirate الزائدة تعليق Agrobacterium. توجيه الأجنة بعناية مع الجانب على شكل قبة تواجه، مع الحرص على تجنب إتلاف الأجنة.
ثم ضع لوحات في صناديق بلاستيكية لاحتضان بين عشية وضحاها في 21 درجة مئوية في الظلام. في صباح اليوم التالي، نقل بعناية الأجنة المصابة على يستريح 605T المتوسطة، ووضع حوالي 30 الأجنة لكل لوحة، scutellum الجانب حتى، لاحتضان لمدة أربعة إلى 10 أيام في 26 درجة مئوية في الظلام. في حوالي سبعة أيام، يمكن ملاحظة تطور الجنين الجسدي على سطح scutellum zygotic.
في نهاية فترة الراحة، ضع صندوق الأجنة في حاضنة 45 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 70٪، لمدة ساعتين، تليها حضانة لمدة ساعة إلى ساعتين عند 26 درجة مئوية في الظلام. في نهاية الحضانة، مكان 10 إلى 15 الأجنة غير ناضجة صدمت الحرارة على لوحات الفردية من اطلاق النار تشكيل المتوسطة تكملها 05 ملليغرام لكل لتر من imazapyr مبيدات الأعشاب كعامل انتقائي. قم بإزالة أي كوليوبtileز بعناية حسب الحاجة، وارجع الأجنة إلى الحاضنة المظلمة 26 درجة مئوية لمدة أسبوعين.
في نهاية الحضانة، نقل حوالي ثماني قطع من الأنسجة لكل لوحة على تجذير لوحات متوسطة لاحتضان لمدة أسبوع إلى أسبوعين مع 16 ساعة من الضوء وثماني ساعات من الظلام عند 27 درجة مئوية. كما المزارعات تطوير، وضع واحدة أقوى بلانتليت تحتوي على كل من يطلق النار وجذور قوية على لوحات الفردية من المتوسط التأصيل تحت الضوء لمدة سبعة إلى 14 يوما آخر. السماح للبراعم التي لم يتم تطويرها بشكل كامل أن تكون محتضنة على نفس الوسيلة لمدة أسبوع إلى أسبوعين آخر حتى تكون جاهزة ليتم نقلها إلى التربة.
كما يصبح النبات أكثر قوة، شطف الجذور مع مياه الصنبور لإزالة أجار. ثم زرع النباتات الفردية في الأواني ثلاثة بوصة تحتوي على الركيزة قبل ترطيب التربة في علبة مع ثقوب استنزاف، ووضع صينية في غرفة النمو مع أو بدون قبة رطوبة بلاستيكية. بعد 9 إلى 14 يومًا من نقل الوعاء ، زرع كل بلانتليت مع التربة في وعاء 1.5 جالون.
إضافة الأسمدة التي تسيطر عليها الإفراج عن وعاء، والحفاظ على النباتات في الدفيئة. عندما تبدأ براعم الأذن في الظهور من المصنع، استخدم حقيبة تبادل لإطلاق النار شبه شفافة لتغطية البراعم بحيث يمكن ملاحظة الحرير الناشئ دون إزالة الحقيبة. ثم تلقيح النباتات في المرحلة المناسبة من التنمية كما هو موضح.
وعادة ما يتم حصاد آذان الذرة بعد تسعة إلى 12 يوما من التلقيح. الأجنة غير الناضجة التي تتراوح أطوالها بين 1.5 و2 ملليمترات هي أفضل explants للتحول لهذا البروتوكول. بعد ثمانية أيام من العدوى، يمكن تصور الأجنة الجسدية التعبيرية ZsGreen بواسطة المجهر الفلوري.
العلاج الحراري بعد ثمانية أيام من العدوى يدفع التعبير إعادة الكومبينيز cre، مما يؤدي إلى استئصال الجينات المورفوجين، cre، وZsGreen الشرائط التعبير يحيط بين موقعين loxP. بعد ثلاثة إلى أربعة أسابيع من الثقافة على اطلاق النار تشكيل المتوسطة التي تحتوي على مبيد الأعشاب، وتكاثر الأنسجة مع الأجنة النضج أو تبادل لاطلاق النار براعم مقاومة لمبيد الأعشاب يمكن ملاحظتها. قد تكون بعض الأنسجة المقاومة لمبيد الأعشاب سلبية بالنسبة لZsGreen ، مما يشير إلى أن الختان بوساطة العقيد من المرجح أن يحدث في هذه الأنسجة.
بعد نقل الأنسجة إلى تأصيل حضانة المتوسطة والخفيفة ، يمكن حصادها صحية ، قوية ، وبراعم النمو مع جذور متطورة. لاحظ أن بعض الأنسجة قد يبدو أن لديها براعم متعددة ربما بسبب النباتات التخفي وجود أنماط التكامل transgene متطابقة. ويمكن لطريقة QuickCorn أن تحسن إلى حد كبير كفاءة تحويل الذرة وتوسع قائمة الأنماط الجينية القابلة للتحويل.
ويمكن أن يستنسخ البروتوكول بنجاح من قبل الباحثين الذين لا يقل تدريبهم عن تحويل الذرة. باستخدام طريقة QuickCorn ، يجب أن تكون النباتات المتجذرة جاهزة للانتقال إلى التربة في غضون خمسة إلى سبعة أسابيع فقط بعد يوم العدوى. انتبه إلى التركيبة المتوسطة وتوقيت الثقافات الفرعية ودرجة الحرارة وظروف الإضاءة.
كما أن جودة مواد البدء ضرورية للتحول الناجح. المواد الكيميائية، ومحلول التبييض، ومبيد الأعشاب المستخدمة في هذا البروتوكول هي الخطر الحيوي. يرجى التأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء استخدامها.
