يسمح لنا هذا البروتوكول بفحص دورة الخلية على مستوى الخلية المفردة باستخدام مقياس الكتلة الخلوية ، وهذا يتيح إجراء العديد من الأبحاث والدراسات السريرية الجديدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي بساطتها. يضاف IdU مباشرة إلى الخلايا وليس هناك حاجة لمزيد من العلاج أو الأجسام المضادة.
لقد استخدمنا هذه التقنية للتحقيق في حالة دورة الخلية في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم النخاعي الحاد داخل حجرات الخلايا الجذعية والسلفية. وهذا يدل على أن خصائص دورة الخلية لهذه الأنواع المحددة من الخلايا قد ترتبط بالنتائج السريرية للمرضى الذين يعانون من هذه الأمراض. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة لفهم خصائص نمو الخلايا السرطانية النادرة وفهم تكاثر المجموعات الفرعية للخلايا المناعية.
قبل وبعد إضافة IdU إلى عينات الخلايا ، حافظ على الخلايا في ظروف النمو ذات الأهمية. في هذه الحالة ، حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية عند 5٪ CO2 لتسمية الخلايا ب IdU ، تمييع محلول مخزون IdU المركز من واحد إلى 50 في وسائط نمو الخلايا. ثم انقل العينات إلى غطاء للسلامة الحيوية وأضف 10 ميكرولتر من وحدة IdU المليمولية الواحدة إلى كل ملليلتر واحد من الخلايا.
أعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 10 إلى 15 دقيقة قبل نقل العينات إلى أنابيب مخروطية فردية. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر وإعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS لكل أنبوب. إذا لزم الأمر ، قم بتسمية الخلايا ببقعة حية / ميتة مناسبة لتمييز الخلايا الميتة.
بعد البقعة الحية / الميتة ، قم بإخماد الخلايا بوسائط مغسولة ب CSM قبل تثبيت الخلايا ب 25 ميكرولترا من 16٪ بارافورمالدهيد. بعد حضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. أضف خمسة إلى 15 ملليلتر من CSM وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من وسط تلطيخ الخلايا المكمل ب 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد. ثم انقل الخلايا إلى أنابيب أصغر لتخزينها في سالب 80 درجة سلزية. لتطبيع تحليل دورة الخلية الخاصة بهم ، قم باستيراد الملفات إلى برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي المناسب وإنشاء مخطط ثنائي المحور لطول الحدث مقابل 191 إيريديوم.
ستشكل الخلايا عددا كبيرا من الإيريديوم الساطع. قم بتغيير مقياس طول الحدث لجعل الخلايا تبدو أكثر بروزا. ثم قم بإنشاء بوابة مفردة لاستبعاد 50 إلى 60٪ من الثنائيات والحطام وقم بتعيين المعلمات الغاوسية المتبقية والإزاحة لإزالة أي ثنائيات وحطام متبقية.
لتعيين بوابة المرحلة S، قم بإنشاء مخطط ثنائي المحور ل IdU مقابل علامة انتشار. ستشكل الخلايا الإيجابية IdU في المرحلة S مجموعة متميزة. بالنسبة إلى بوابات G0 / G1 و G2 / M ، قم بإنشاء البوابات على قطعة أرض IdU مقابل Cyclin B1.
ستكون المرحلة G0 / G1 منخفضة Cyclin B1 ، و IdU سلبية ، وستكون مرحلة G2 / M عالية Cyclin B1 ، و IdU سلبية. لبوابة لأنواع معينة من الخلايا ، ارسم فقط خلايا الطور S على الرسم البياني Cyclin B1 مقابل IdU للمساعدة في إنشاء الفصل بين خلايا المرحلة G0 / G1 وخلايا الطور G2 / M. ارسم بوابة حول ارتفاع عدد السكان في Cyclin B1.
في بعض الحالات ، قد يكون من الصعب تمييز ذلك ، لكن مستوى Cyclin B1 لأعلى 5٪ تقريبا من سكان المرحلة S هو عادة نقطة التوقف بين بوابات المرحلة G0 / G1 و G2 / M. ستكون الخلايا الموجودة داخل البوابة السابقة هي مجموعة الطور G2 / M ، بينما ستكون الخلايا المتبقية هي مجموعة الطور G0 / G1. لتحديد مجموعة المرحلة G0 ، قم بإنشاء بروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر مقابل مخطط IdU.
سيتم تمثيل المرحلة G0 ببروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر المنخفض ، والسكان السالبون IdU. نظرا لأن السكان النشطين لركوب الدراجات سيظهرون بروتين الورم الأرومي الشبكي عالي الفسفرة ودمج IdU ، يمكن رسم بوابة المرحلة G0 على هذه الحدود لأنها تعبر عادة عن مجموعتين متميزتين. إذا كان من الصعب تحديد بوابة G0 ، فاجعل سكان المرحلة S هم السكان النشطون وارسم بوابة تضم أعلى 90 إلى 100٪ من بروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر.
عادة ما يكون بروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر المنخفض خارج البوابة هو عدد G0 ، في حين أن خلايا G0 / G1 ذات مستويات pRb التي تقع في هذه البوابة هي خلايا G1. بالنسبة للبوابات ذات الطور M ، قم بإنشاء IdU مقابل هيستون H3 المفسفر عن طريق المخطط المحوري. سيتم ملاحظة المرحلة M على أنها جزء صغير جدا من الخلايا داخل مجموعة هيستون H3 المفسفرة.
الخلايا في السكان G2 / M مع مستويات أقل من pHH3 هي خلايا G2. إذا فشل دمج IdU أو لم يكن ممكنا ، فحدد كسور الخلايا الدائرية وليس التدوير باستخدام Ki67 وبروتين الورم الأرومي الشبكي المفسفر. سيمثل السكان الإيجابيون المزدوجون السكان النشطين لركوب الدراجات المرتبطين بمراحل G1 و S و G2 و M.
سيمثل عدد السكان المنخفض المزدوج السكان غير الدراجين المرتبطين بمرحلة G0. بمجرد إنشاء جميع البوابات ، قم بتصدير القيم العددية من البوابات. يمكن تحقيق النسب المئوية في كل دورة عن طريق طرح المجموعات الفردية من المجموعات السكانية المجمعة لإنشاء قيم عددية لكل مرحلة من مراحل دورة الخلية الفردية للرسوم البيانية والتحليل الإحصائي اللاحق.
يعد إنشاء البوابة المفردة أمرا مهما لفصل الحطام الخلوي والزوجي للسماح بعزل مجموعة الخلايا المفردة. يمكن بعد ذلك إجراء تحليل دورة الخلية للخلايا المفردة. يمكن أن يتأثر وضع العلامات على IdU وبالتالي تحليل دورة الخلية النهائية بشكل كبير بالوقت ودرجة الحرارة.
على سبيل المثال ، الخلايا التي تبقى لفترة طويلة جدا في الأوعية المغلقة أو في النقل بين المواقع ستقلل من كسور الطور S ولن يكون ذلك دقيقا لتحليل دورة الخلية. لا تزال عينات الخلايا المحتفظ بها لفترات قصيرة من ساعة أو أقل تظهر توزيعا طبيعيا لدورة الخلية ، مما يشير إلى أن النقل السريع قد لا يؤثر سلبا على التحليل. قد تتطلب الخلايا المحفوظة بالتبريد فترة توازن طويلة قبل أن تعود الخلايا إلى دورة الخلية النشطة ، والتي قد لا تعكس حالة دورة الخلية قبل الحفظ بالتبريد.
قد تتأثر أنواع الخلايا المختلفة أيضا بشكل مختلف بظروف الصيانة. على سبيل المثال ، في عينة نخاع العظم البشري هذه ، أظهرت الخلايا التائية انخفاضا في أعداد الخلايا مقارنة بالخلايا الأحادية من نفس العينة. فائدة أخرى لقياس الكتلة الخلوية هي القدرة على تمييز الخلايا في توقف دورة الخلية أو التي لها توزيع غير طبيعي لدورة الخلية.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها متوافقة بسهولة مع قياسات قياس الكتلة الخلوية الأخرى مثل التنميط الظاهري السطحي ، وهيكل الكروماتين ، وتحفيز السيتوكين داخل الخلايا ، والتي يمكن ربطها بحالة دورة الخلية. لقد استخدمنا هذه التقنية لدراسة استنفاد الخلايا المناعية ، والشيخوخة ، ولإظهار أن الاستجابة للعلاج الكيميائي في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الحاد قد ترتبط بخصائص دورة الخلية لخلايا سرطان الدم.
