ولا تسمح الـ RT-PCRs التقليدية بالتمييز بين تسلسل المعنى والتسلسلات المضادة للحس عند استخدامها للكشف عن الحمض النووي الرنا المشفّر بواسطة الجينات المتداخلة. هذا البروتوكول يجعل من الممكن للكشف عن RNAs المضادة للحس على وجه التحديد. استخدام الشعيرات biotynylated جنبا إلى جنب مع ارتفاع درجات حرارة DENaturation RNA يسمح لتضخيم مضادة للحس cDNAs، ومنع تشكيل منتجات RT غير محددة.
لقد استخدمنا هذه الطريقة لإثبات أن ASP إما كـ RNA المضادة للحس أو السلائف البروتينية، انها مستضد فيروس نقص المناعة البشرية الجديد، فإنه يحتمل أن يكون هدفا فيروس نقص المناعة البشرية رواية للعلاج. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام، حيث يمكن الكشف عن RNAs المضادة للحس من الجينات المتداخلة. ابدأ بتصميم التمهيديات المحددة للمريض باستخدام تسلسل الحمض النووي المؤيد للفيروسات الداخلية لـ PanASP التمهيدية.
بعد ذلك ، كمي الحمض النووي الريبي والقضاء على تلوث الحمض النووي عن طريق معالجة العينات مع DNase. نقل بين 0.1 و ميكروغرام واحد من مجموع RNA إلى الآبار المناسبة على 96 بئراً من الألواح PCR. ثم قم بإعداد النسخ العكسي ، أو رد فعل RT ، وفقًا لاتجاهات المخطوطات.
إعداد ضوابط RT الذاتية عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات من المياه الحرة النوى بدلا من التمهيدي عكس ASP. وضع لوحة في الترموسل والحرارة الجيش الملكي النيبالي إلى 94 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم تبريده على الفور في الماء المثلج لمدة دقيقة واحدة على الأقل.
إعداد خليط التفاعل في أنبوب 1.5 ملليلتر كما هو موضح في مخطوطة النص، ثم نقل 17.5 ميكرولترات إلى كل من الآبار التي تحتوي على RNA. يجب إجراء denaturation RNA في 94 درجة مئوية. وبدون التشبع الكلي بالتهريب، قد تحدث توليفات من المنتجات غير المحددة من الحمض النووي الريبي الحس، مما يؤدي إلى تضخيم الحمض النووي الريبي غير المحدد.
اخلط محتويات الآبار بلطف ويحضن الصفيحة عند درجة حرارة 55 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ثم، تعطيل ردود الفعل عن طريق تسخين لوحة إلى 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إعداد لتر واحد من 2X الغسيل ومخزن ملزم وفقا لاتجاهات المخطوطات وتصفية الحل.
المقبل, إعداد 50 ملليلتر من 1X الغسيل ومخزن ملزم باستخدام المياه الصف PCR. نقل العدد المناسب من الخرز المغناطيسي streptavidin-مترافق إلى أنبوب 1.5 ملليلتر ثم غسلها عن طريق إضافة حجم متساو من 2X الغسيل ومخزن ملزم ودوامة الأنبوب لمدة 15 ثانية. ضع الأنبوب في رف فصل مغناطيسي واحتضانه لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم، بعناية إزالة افرات دون إزعاج الخرز وإضافة نفس حجم الغسيل 2X ومخزن ملزم كما الحجم الأولي من الخرز. دوامة الخرز لمدة 30 ثانية ونقل 10 ميكرولترات من التعليق إلى عدد مناسب من 1.5 ملليلتر أنابيب. ضع الأنابيب في رف الفصل المغناطيسي وحضنها لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ثم، والتخلص من عظمى وإضافة 50 ميكرولترات من 2X الغسيل ومخزن ملزم. إضافة 50 ميكرولترات من سي نا biotynylated إلى الأنابيب المقابلة مع الخرز واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في حين تناوب بلطف. بعد الحضانة، ضع الأنابيب على رف الفصل المغناطيسي لمدة ثلاث دقائق ثم غسل الخرز مع 200 ميكرولترات من 1X الغسيل والموانع المؤقتة الملزمة، تليها حضانة لمدة ثلاث دقائق على رف الفصل.
تجاهل المابير وكرر الغسيل مرتين. ثم، resuspend الخرز في 10 ميكرولترات من المياه الصف PCR. إعداد حجم مناسب من PCR ماجستير ميكس وفقا لاتجاهات المخطوطة.
اخلطه جيداً و سرعان ما يدور عليه، ثم نقل 49 ميكرولترات لكل بئر إلى لوحة PCR 96 بشكل جيد. دوامة بعناية الأنابيب مع cDNA المنقى لمدة 15 ثانية وإضافة ميكرولتر واحد من التعليق إلى الآبار المقابلة. تشغيل PCR وفصل المنتجات على جل agarose 1٪.
قطع العصابات من هلام واستنساخ المنتجات المكبوخة في PCR 2.1 plasmid. ثم تسلسل المستنسخين وتحليل كل تسلسل. تم تنفيذ ردود الفعل RT الأولية مع التمهيدي العادي غير biotynylated المضادة للحس وأسفرت عن التضخيم الناجح ل ASP.
ومع ذلك ، تم تضخيم نطاق من نفس الوزن الجزيئي والضوابط ناقص التمهيدي. لتجاوز هذه المشكلة، تم تسمية التمهيدي المضادة للحس محددة مع biotyn وcDNA المضادة للحس الناتجة تم تنقيتها قبل PCR. وهذا ما جعل من الممكن تضخيم تسلسل ASP مع انخفاض التلوث بشكل كبير من cDNA غير محددة في التمهيدي ناقص الضوابط.
وقد تحقق المزيد من التحسين لهذه الطريقة عن طريق التكتّن الكامل للرنا في 94 درجة مئوية قبل RT، تليها التبريد الفوري على الماء المثلج، مما أدى إلى تضخيم فعال لـ النطاق ASP ولا توجد منتجات غير محددة. تم قياس حركية RNA ASP وخلايا CD4 معزولة عن ثلاثة أشخاص إيجابية لفيروس نقص المناعة البشرية مع viremia يمكن الكشف عنها وغياب العلاج بعد التحفيز مع CD3/CD28 المضادة. وكان من الممكن أيضا تحديد كمية من RNA ASP في المرضى الذين يخضعون للعلاج المضاد للفيروسات القهقرية، مع viremia غير قابلة للكشف.
في اثنين من أصل ثلاثة مرضى، تم الكشف عن RNA ASP في مستويات منخفضة في ثلاثة إلى خمسة أيام بعد التحفيز. تم تحليل اثنين من المرضى ل ASP و RNAs env، واحد غير المعالجة وواحد عولج. بالنسبة للمريض غير المعالج، يمكن الكشف عن كل من الرنا.
بالنسبة للمريض المعالج ، كان ASP والإنف بالكاد يمكن اكتشافهما بعد عدة أيام من التحفيز. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن denaturation خطي RNA بحيث يتم تدمير الهياكل الثانوية قادرة على RT رئيس. في حين أن غسل الخرز يتدفق بعيدا cDNAs غير biotynylated.
بعد تنقية cDNAs مع قطبية الصحيح، يمكن إجراء qPCR لتحليل التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، يمكن استنساخ الحمض النووي الموحد أيضاً واستخدامها في تحليل التسلسل. هذه الطريقة تسمح لدراسة الجينات المتداخلة في الاتجاه المعاكس، وقد تكون مفيدة في توضيح التنظيم والعوامل المسببة للأمراض من البكتيريا والأمراض المرتبطة بالفيروس بما في ذلك بعض أنواع السرطان.
