هذا هو بروتوكول بسيط لتوليف وظيفية ، وشبه الأشعة تحت الحمراء التي تنبعث منها الفوتوناتية الذهب الكشف عنها والكشف عنها باستخدام الإعداد التجاري. واحدة من المزايا الرئيسية لهذه التقنية هو أن مرفق من ليجوند ثيول وظيفية واقتران ليغاند أمين وظيفية على سطح نانوقود الذهب لا يؤثر سلبا على خصائص فوتووميينسنت والاستقرار لفائف. ويمكن تصور أن الجمع بين خصائص الإضاءة الضوئية المكثفة والاقتران مع الجزيئات الحيوية سيسمح للكشف في المختبر عن أنيليسيد منخفضة التركيز، والنفس الحيوي، والذوبان، والتصوير الحيوي.
إثبات الإجراء سيكون كلوديا كفاكوفا، طالب الدكتوراه بلدي. سيتم إثبات عملية استئصال التدفق من قبل مساعدة الأبحاث ألبيتا ماغدولنوفا. سيتم عرض الجزء المجهري من قبل فاكلاف بوكان، وهو طالب غراد من مختبر لينكا ليبوسوفا.
ابدأ بإضافة 7.8 ملليغرام من حمض ثيوكتيك في 60 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم من نوع اثنين من المولار إلى 23.4 ملليلتر من الماء فائق السخ وتحريك الخليط حتى يذوب تماما. أضف التالي 10.2 ميكرولترات من رابع كلوريد الهيدروجين إلى المحلول، وبعد 15 دقيقة، إضافة 480 ميكرولترات من بوروهيدريد الصوديوم الطازجة المعدة أثناء التحريك بقوة. مواصلة اثارة خليط التفاعل بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي ، قم بتنقية الحل باستخدام ثلاث دورات من الترشيح الفائق مع قطع الوزن الجزيئي من ثلاثة كيلودالون ، ثم إضافة 15.6 ملليغرام من البولي إيثيلين منتهية الغليكول إلى المحلول ، وضبط درجة حُكم الH إلى ما بين 7 و 7.5 ، وحركة الخليط بين عشية وضحاها للحصول على نانوكلستر 1. في اليوم التالي، كرر ثلاث دورات من الطرد المركزي والترشيح لتنقية التشتت. اخلط محلول نانوكستر 1 مع برنامج النقاط التجارية، ثم اضبط درجة PH إلى 4.5 مع كلوريد الهيدروجين المولر الواحد.
بدء التفاعل عن طريق إضافة فائض من EDC HCL ورصد درجة ح H من الخليط للساعة الأولى. إذا زاد الـ (PH) فوق ستة، قللي منه بإضافة كلوريد الهيدروجين. يُحرّك خليط التفاعل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
في اليوم التالي، تنفيذ ثلاث دورات من الطرد المركزي والترشيح كما هو موضح سابقا للحصول على نانوكلستر 2. تمييع 2 مع الماء فائقة الخطورة إلى حجم 24 ملليلتر. بذور الخلايا في لوحة 12-جيدا في كثافة 20،000 الخلايا في البئر.
احتضان لهم لمدة 48 ساعة، ثم pirate المتوسطة وإضافة 400 ميكرولترات من ثقافة كاملة المتوسطة مع أو بدون 500 ميكروغرام من الجسيمات النانوية في بئر. إعادة الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية لاداخلية نانوكلستر. بعد ساعتين، قم بفصل الخلايا باستخدام التربسينية القياسية.
جمعها في أنابيب الطرد المجهري البولي بروبلين وأجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 350 مرات ز وأربع درجات مئوية. إعداد المخزن المؤقت FCM وفقا لاتجاهات المخطوطات واستخدام ملليلتر واحد من العازلة لغسل الكريات الخلية. أجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة خمس دقائق أخرى، ثم إعادة تعليقها في 500 ميكرولترات من العازل FCM وتخزينها في أربع درجات مئوية.
قبل الحصول على العينة، تأكد من أن الصك لديه التكوين البصري المقابلة. ضع 780 أكثر من 60 فلتر bandpass أمام كاشف 405A. تصفية جميع العينات باستخدام أنبوب البوليسترين خمس ملليلتر مستديرة القاع مع غطاء مصفاة الخلية.
تحديد تكوين مقياس السيتات. رسم رسم نقطة معلمتين من FSC-A و SSC-A لإظهار توزيع الخلايا. لاستثناء المضاعفة، قم بإنشاء رسم نقطة ثنائي المعلمة من FSC-H مقابل FSC-A و رسم مدرج مدرج تكراري أحادي المعلمة لمنطقة القناة الفلورية لمراقبة كثافة الفلورس في العينة.
الحصول على عينة غير المعالجة بمعدل تدفق منخفض لتقليل الأحداث المتزامنة. أثناء الاستحواذ ، قم بضبط الفولتية PMT للحصول على السكان غير المعالجين على نطاق واسع على مؤامرة FSC مقابل SSC. إذا لزم الأمر، ضبط الفولتية PMT لقناة FL لوضع السكان غير المطهية على الزاوية اليسرى من الرسم البياني.
ثم حدد علامة تبويب البوابة المحددة في البرنامج وارسم بوابة مناسبة حول السكان المطلوبين. الخلايا داخل البوابة ستنتقل إلى نقطة التفتيش التالية قم بإعداد التجربة وتسجيل البيانات.
في 24 ساعة بعد البذر، إضافة 100 ميكروغرام من 2 إلى كل غرفة طبق تحتوي على 0.5 ملليلتر من المتوسطة مع خلايا هيلا. إعادة الطبق إلى الحاضنة والسماح للخلايا إلى استيعاب نانوتقود، ثم تجاهل المتوسطة وغسل الخلايا مع مسبقة الاحتياز، والمتوسطة الطازجة. املأ كل غرفة بـ 800 ميكرولترات من الوسط الطازج، وامضي في التصوير.
لتصوير الخلايا، استخدم مجهرًا مشتركًا مع Plan-APOCHROMAT وعدسة هدفية 63x للنفط. قم بتركيب الطبق على المسرح المقلوب مع الغرفة التي تم تسخينها حتى 37 درجة مئوية وزودها بغلاف جوي مرطب 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. الكشف عن جسيمات نانوية ذهبية داخلية باستخدام ليزر 405 نانومتر تعيين إلى 2٪ قوة مع تقسيم شعاع المناسبة، وتحديد نطاق موجات الكشف بين 650 و 760 نانومتر.
تعيين دقة الصورة إلى 2048 بواسطة 2048 بكسل. في إعداد سرعة الاستحواذ ، تهدف إلى بكسل يسكن الوقت حول أربعة ميكروثانية والحصول على الصورة مع متوسط مرتين ، ثم تعيين الثقب على وحدة منطقة واحدة ، وحساسية أعلى ، واستخدام وضع العد الفوتون. للإضاءة الصحيحة والضوء المنقول مع DIC استخدام إعداد كوهلر من المكثف ووقف الميدان.
للحصول على الضوء المنقول، استخدم ليزر 488 نانومتر بقوة 0.7٪ دون أي جهاز للكشف عن الفلورسينس المخصص، مع التأكد من تعيين تقسيم شعاع مناسب للطول الموجي بالليزر. وأشارت أطياف الامتصاص إلى أن الكتل النانوية الذهبية 1 و2 لا تحتويان على نطاق بلاسمون سطحي مميز وتظهر انبعاثات واسعة من 550 إلى 850 نانومتر. زادت الإضاءة الضوئية بقوة بعد ارتباط برنامج النقاط التجارية على سطح 1.
كما كانت الانبعاثات من المجموعات النانوية مرئية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر. كان الانبعاثات مستقرًا وكان طول موجيته مستقلًا عن الطول الموجي للإثارة ولكن كانت الشدة قصوى عندما كانت متحمسة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. تم استخدام قياس الخلايا التدفق لتأكيد امتصاص نانوتكستر 2 من قبل خلايا HeLa.
كان بالقرب من الفلورا على حد سواء تعتمد على حضانة الوقت وتركيز نانوكلستر 2. تم تصوير الـ nanoclusters الذهب داخل الخلايا بشكل غير تلقائي مع مجهر مسح ليزر مشترك قياسي. كانت الخلايا ملطخة بالنانو كوستر 2 ، وبعد 24 ساعة من الحضانة ، لوحظت الإضاءة الضوئية الحمراء الساطعة داخل الخلايا.
عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم أن نتذكر أن إزالة borohydride الصوديوم غير المنقحة والمائية مهم جدا، وإلا ثيولated البولي ايثيلين جلايكول لن ترتبط على سطح نانوكلوستر الذهب. بالإضافة إلى ذلك، يبدأ الضوئية من اللودادات النانوية الذهبية من 560 نانومتر. لتجنب الخلفية autofluorescent في تجارب المجهر confocal ، ينبغي جمع الفوتونات فوق 650 نانومتر.
