يوفر هذا البروتوكول نظام عرض بكتيري فعال للغاية لعزل المتغيرات الجديدة من BirA التي تسمح بتنينيل حيوي محدد للبروتينات الأصلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تختار متغيرات BirA باستخدام اختيار streptavidin عالي التقارب. وهذا يضمن إزالة المستنسخات غير النشطة، وبالتالي إنشاء عملية اختيار عالية الكفاءة.
لتبدأ، في محرر البلازميد، تصميم التمهيدي إلى الأمام لتشمل آخر 30 النيوكليوتيدات من تكملة عكسي من تسلسل الترميز الببتيد، وإضافة تسلسل النيوكليوتيدات ملزمة plasmid إلى نهايتها خمسة رئيس الوزراء. تصميم التمهيدي العكسي لتشمل أول 30 النيوكليوتيدات من الملحق العكسي لتسلسل ترميز الببتيد، وإضافة تسلسل النيوكليوتيدات ملزمة plasmid إلى نهايتها خمسة رئيس. ثم، لإعداد تفاعل PCR 20 ميكرولتر، إضافة الكواشف في أنبوب PCR رقيقة الجدران.
نقل الأنبوب إلى دورة حرارية، وإجراء PCR وفقا للمخطوطة. بعد ذلك، قم بتشغيل خمسة ميكرولترات من تفاعل PCR على هلام agarose بنسبة 1٪لتأكيد تضخيم منتج PCR بست كيلو، والمضي قدما وفقا للمخطوطة. الآن ، لتجميع megaprimers متحولة مع بيرا hexahistidine إلى الأمام وعكس التمهيديات ، في أنبوب PCR ، إضافة نانوغرام واحد من pBAD - BirA - eCPX مع تسلسل الببتيد الهدف المعدة كقالب.
اقامة 35 دورة PCR مع درجة حرارة 60 درجة مئوية من الصلب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم، تشغيل خمسة ميكرولترات من رد فعل التضخيم على هلام agarose 1٪للتحقق من تضخيم منتج PCR زوج 984 قاعدة. تنقية المنتج PCR من 45 ميكرولترات المتبقية من تفاعل التضخيم باستخدام مجموعة تنقية PCR التجارية، واستخدام مقياس الطيفي لكمية العائد الحمض النووي.
في أنبوب PCR رقيقة الجدران، إضافة الكواشف في megaprimers متحولة أعدت لإعداد رد فعل العينة. نقل خليط التفاعل إلى دورة حرارية، وتشغيل PCR وفقا للمخطوطة. تخزين رد فعل التضخيم في أربع درجات مئوية أو على الجليد.
بعد ذلك، أضف ميكرولتر واحد من إنزيم تقييد Dpn1 مباشرة إلى تفاعل التضخيم، واخلط بلطف. تدور أسفل خليط التفاعل، واحتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية. بعد ساعتين، تحويل T7 Express lysY/Iq الخلايا الإشريكية القولونية المختصة في أنبوب مع اثنين من microliters من رد فعل Dpn1.
أولا، تلقيح 100 ملليلتر من LB تحتوي على 1٪ الجلوكوز و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين مع ملليلتر واحد من مكتبة بيرا، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة. ثم، تلقيح خمسة ملليلتر من LB تحتوي على 1٪ من الجلوكوز و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين مع 100 ميكرولترات من ثقافة بين عشية وضحاها. احتضان لمدة ساعتين و 30 دقيقة أو حتى الثقافة تصل إلى OD600 من حوالي 0.5.
المقبل, حث ECPX و BirA التعبير مع 0.2٪ الوزن من قبل حجم L-arabinose, 100-micromolar IPTG, و 100-بيوتين micromolar. هز الثقافة عند 200 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. الطرد المركزي ثقافة لمدة 10 دقائق في 5،000 مرات ز، وإزالة الفائق.
إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS، والطرد المركزي في 5،000 مرات ز لمدة خمس دقائق. تجاهل الماثرة، وإعادة تعليق الخلايا في 400 ميكرولترات من الجليد البارد برنامج تلفزيوني، وتخزين الخلايا على الجليد. ثم، نقل 10 ميكرولترات من الخلايا resuspended إلى أنبوب 1.5 ملليلتر يسمى الإدخال.
تخزين على الجليد. المقبل، وغسل 20 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي streptavidin في ملليلتر واحد من الجليد البارد برنامج تلفزيوني في أنبوب، ووضع الأنبوب في فاصل الجسيمات المغناطيسي benchtop لمدة دقيقتين، وإزالة بعناية supernatant. Resuspend الخرز المغناطيسي streptavidin في 20 ميكرولترات من الجليد البارد برنامج تلفزيوني ، ونقل محلول حبة إلى 390 ميكرولترات أعدت السابقة من الخلايا resuspended.
مزيج عن طريق الأنابيب بلطف. ثم، احتضان لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. ضع عمودًا مع مجالات مغناطيسية في فاصل جسيمات مغناطيسية ، واغسل بخمسة ملليلترات من PBS باردًا.
نقل الخلايا والخرز المغناطيسي streptavidin من أنبوب في العمود المرفق في الفاصل. بمجرد أن يكون خزان العمود فارغًا ، اغسل العمود بحجم إجمالي قدره خمسة ملليلترات من PBS الباردة الجليدية عند 500 ميكرولتر في كل مرة. بعد ذلك، قم بإزالة العمود من الفاصل، وضعه في أنبوب 1.5 ملليلتر.
الماصات ملليلتر واحد من PBS الجليد الباردة على العمود، واستخدام المكبس ل elute الخلايا المسمى مغناطيسيا. ثم، ضع أنبوب 1.5 ملليلتر في فاصل مقاعد البدلاء، وغسل الخلية التي تحمل علامة مغناطيسية مع ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS. إعادة تعليق بلطف الخلايا التي تحمل علامة مغناطيسية في ملليلتر واحد من الجليد البارد PBS.
نقل 10 ميكرولترات من resuspension إلى أنبوب 1.5 ملليلتر الانتاج المسمى. تلقيح 100 ملليلتر من LB تحتوي على 1٪ من الجلوكوز و 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين مع الخلايا التي تحمل علامة مغناطيسية، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي، والجمع بين 10 ملليلتر من ثقافة بين عشية وضحاها في LB مع الجلسرين إلى تركيز النهائي من 15٪، وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية لجعل مخزونات الفريزر.
استخدام 100 ميكرولترات من ثقافة بين عشية وضحاها للجولة المقبلة من الاختيار. الآن ، إضافة 990 microliters من الجليد البارد برنامج تلفزيوني لكل من عينات المدخلات والمخرجات ، وتسمية أنابيب المدخلات 10 إلى ناقص اثنين والمخرجات 10 إلى ناقص اثنين ، على التوالي. جعل 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية من العينتين في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة حتى يتم التوصل إلى تخفيف النهائي من 10 إلى ناقص 10 في عينة المدخلات و 10 إلى ناقص أربعة في عينة الإخراج.
لوحة 100 ميكرولترات من العينات من المدخلات 10 إلى ناقص ستة، وإدخال 10 إلى ثمانية ناقص، وإدخال 10 إلى ناقص 10، والإخراج 10 إلى ناقص اثنين، وإخراج 10 إلى ثلاثة ناقص، وإخراج 10 إلى ناقص أربعة على لوحات LB-ampicillin الفردية، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في الصباح، عد عدد المستعمرات على لوحات مع مستعمرات منفصلة بوضوح. اضرب عدد المستعمرات مع عامل التخفيف للحصول على عدد تركيزات البكتيريا لكل 100 ميكرولترات.
في هذا البروتوكول، بعد إنشاء مكتبة متحولة عشوائيا من المتغيرات بيرا، وكان حث بيرا وeCPX-AP التعبير. تم احتضان البكتيريا مع مع الكاشف تقارب، تم التخلص من البكتيريا غير المنضمة، وتضخيم البكتيريا المختارة. أنتجت البقعة الغربية من pBAD-BirA-eCPX-AP التي تعبر عن البكتيريا شريطًا يتفاعل مع 22 كيلوdalتون متوافق مع الوزن الجزيئي لـ eCPX في الثقافات غير المستحثة والمستحثة على حد سواء.
ومع ذلك، لم تكن موجودة في الهكسيستيدين بيرا. تسبب التنينيل الحيوي السطحي القوي في البكتيريا المعبرة عن eCPX-AP في التجميع عند إضافة الخرز المغناطيسي streptavidin وتشكيل بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب ، وهو ما لم يتم ملاحظته مع eCPX مع اللين إلى بكتيريا التعبير عن الطفرة ألانين. تحليل العجلة من سحب streptavidin عرض واضحة 22 كيلودالون streptavidin رد فعل ومكافحة hexahistidine الفرقة في العينات من الثقافات eCPX-AP ولكن ليس eCPX-AP مع ليسين لثقافات الطفرات ألانين.
وبالمثل، كان عدد البكتيريا المرتبطة الخرز streptavidin أعلى بكثير في eCPX-AP من eCPX-AP lysine إلى ثقافات الطفرات ألانين. الخطوة الأكثر أهمية هي غسل صارم للبكتيريا المرتبطة بالعصية. يضمن الغسيل الصارم أن يتم اختيار البكتيريا فقط مع البيوتين المعروضة على السطح.
مرة واحدة لوحظ الإثراء الواضح للبكتيريا، يمكن أن تكون أكثر تحور استنساخ معزولة وبالتالي تطوير المتغيرات BirA نشطة للغاية التي تسمح بتنينيل حيوي محدد من البروتينات المحلية.
