يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج ماوس جديد لدراسة فطر الجلد ، Malassezia ، وتفاعله مع الجلد الثديي في الجسم الحي. على النقيض من النهج في المختبر، وهذا النموذج العدوى يسمح لدراسة آليات المناعة الفطرية والتكيفية ضد Malassezia في تعقيد كامل وبطريقة محددة الأنسجة. يرتبط الملاسيزيزيا باضطرابات جلدية مختلفة، مثل التهاب الجلد التأتبي.
قد فهم الاستجابة المناعية للفطريات تقديم استراتيجيات جديدة لعلاج مثل هذه الأمراض الجلدية الالتهابية المتكررة والمزمنة. عدوى الجلد التجريبية مع Malassezia يوفر نموذجا طال انتظاره لدراسة كيفية الفطريات الجلد commensal تعدل الجهاز المناعي، وبالتالي تؤثر على مسار وشدة اضطرابات الجلد المختلفة. لإعداد inoculum Malassezia إضافة 10 ملليلتر من السائل mDixon المتوسطة وثلاث إلى خمس مستعمرات مالاسيزيا الفردية من لوحة أجار mDixon إلى 100 ملليلتر قارورة عقيمة.
ثم ضع القارورة عند 30 درجة مئوية و 180 دوران في الدقيقة لمدة 48 إلى 96 ساعة. عندما تكون الثقافة كريم الملونة والعكر، نقل مليلترين من الثقافة في أنبوب معقم ميليلتر microcentuge والرواسب الخميرة عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني للطرد المركزي الثاني تليها resuspension في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد مع الأنابيب قوية.
تخفيف تعليق Malassezia 20 إلى 50 مرة مع برنامج تلفزيوني لضمان أن القراءة بين 0.1 واحد وقياس OD 600 على مطياف. Aliquot حجم تعليق Malassezia في PBS الذي يتوافق مع OD 600 من أربعة في أنبوب واحد معقمة اثنين ملليلتر لكل أن تكون مصابة والرواسب الخميرة عن طريق الطرد المركزي. ثم إعادة تعليق الكريات في 200 ميكرولترات من زيت الزيتون الأصلي.
لبدء عدوى Malassezia، تأكيد عدم وجود استجابة لدواسة منعكس في تخدير ستة إلى ثمانية أسابيع أنثى C57 Black6 الماوس وتطبيق مرهم على عيون الحيوان. استخدم الفرجار لقياس سمك منطقتين مختلفتين من كلا الأذنين للسماح بحساب متوسط سمك الأذن الواحدة. ثم تطبيق قطعة صغيرة من الشريط على جلد أذن واحدة قبل إزالة الشريط بسرعة من جلد الأذن خمس مرات باستخدام قطعة جديدة من الشريط في كل مرة.
بعد تجريد، واستخدام ماصة معقمة لتطبيق 100 ميكرولترات من تعليق زيت الزيتون Malassezia إلى الجانب الظهري من كل أذن وحقن 200 ميكرولترات من معقمة، قبل 2٪ الجلوكوز حل تحت الجلد في حظيرة الأنف لدعم التمثيل الغذائي وإماهة. ثم تسمح للماوس لاسترداد على وسادة التدفئة لمدة 30 دقيقة مع الرصد قبل العودة إلى قفص الحيوان. عند نقاط الوقت التجريبي المناسبة، استخدم الفرجر لقياس منطقتين مختلفتين لكل أذن فأرة للسماح بحساب متوسط سمك الأذن الواحدة.
لقياس العبء الفطري في الجلد المصاب، إضافة 500 ميكرولتررس من 0.05٪NP40 معقمة في الماء المقطر وacclaved خمسة ملليلتر قطرها الكرة الفولاذية إلى واحد اثنين ملليلتر ميكروسنتريفوج أنبوب لكل أذن وتزن كل أنبوب على التوازن. بعد ذلك ، حصاد الأذنين من كل في القاعدة ووضع الأنسجة في أنابيب فردية من NP40. وزن كل أنبوب على التوازن لتحديد وزن كل عينة الأذن قبل تجانس أنسجة الأذن لمدة ست دقائق في 25 هيرتز.
ثم الاستغناء 100 ميكروليتر من كل عينة على لوحات أجار mDixon وتوزيع التعليقات بشكل متجانس عبر أجار قبل احتضانها رأسا على عقب في 30 درجة مئوية. هنا صور تمثيلية لنمو sympodialis Malassezia في السائل mDixon المتوسطة وعلى mDixon أجار كما هو مبين هي مبين. ويمكن ملاحظة زيادة في سماكة الأذن بعد تطبيق الفراء Malassezia على الجلد الذي تم تعطيل حاجز بالمقارنة مع الجلد غير مضطرب من نوع البرية C57 الأسود الفئران.
في الواقع، يكشف القياس الكمي للزيادة في سماكة الأذن بمرور الوقت أن التغير في سمكه كبير مقارنة بالبشرة المعالجة للمركبة. علاوة على ذلك ، فإن العبء الفطري في جلد الأذن في اليوم الثاني بعد الإصابة بـ Malassezia pachydermatis أعلى من حد الكشف 100 إلى 1000 مرة. يميل الملاسيزيزيا إلى تكوين مجاميع وليس من السهل تعليقها.
لذلك ، ضمان تجانس تعليق الفطريات النفطية من خلال دوامة واسعة النطاق. قراءات إضافية قد تشمل، علم الأنسجة لتحديد أمراض الجلد وعزل الخلايا المناعية من الجلد واستنزاف الغدد الليمفاوية للتحقيق في الاستجابة المناعية المضادة للفطريات. هذا النموذج يفتح الفرص لدراسة الاستجابة المناعية ضد Malassezia والتحقيق في دور الفطريات باعتبارها commensal في سياق اضطرابات الجلد المختلفة.
تصنف أنواع الملاسيزيزيا ككائنات BSL-2 في بعض البلدان. تأكد من اتباع تنظيم السلطات المحلية واستخدام تدابير السلامة المناسبة.
