رابطة الدول المستقلة العناصر التنظيمية مثل المروجين والمعززات هي المحددات الرئيسية للتعبير الجيني. النهج التقليدية لدراسة هذه العناصر شاقة وغالبا ما تنطوي على استخدام الجينات مراسل غير مغايرة. هنا نبرهن على استخدام CRISPR لفحص دور النسخية كاتم الصوت INTRONIC RUNX1 في خط خلية سرطان الدم.
البروتوكول بسيط التنفيذ ويسمح بإجراء تقييمات سريعة لوظائف تنظيم الجينات في سياق الجينات الذاتية. خلايا الدم غالبا ما يكون من الصعب transfect مع أساليب plasmid القائم. في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم electroporation لتقديم Cas9 مجمعة مسبقا، دليل الجيش الملكي النيبالي، المجمعات في الخلايا.
وتشمل مزايا هذا النهج استخدام كفاءة التحرير المحسنة وقابلية الخلية للاستمرار، فضلا عن تقليل الآثار خارج نطاق الهدف. كما أن الاستخدام اللاحق لتحليل الأجزاء يتيح إجراء فحص بسيط وسريع للمستنسخات المتحولة المرغوبة من كمية كبيرة من العينات. إثبات الإجراء سيكون يوك لين يونغ، فني لمختبري.
تبدأ من خلال تصميم اثنين من RNAs كريسبر، واحد خمسة رئيس الوزراء والأخرى ثلاثة رئيس الوزراء من العنصر التنظيمي رابطة الدول المستقلة الهدف، أو CRE. تأكد من وجود PAM من NGG مباشرة من التسلسل المستهدف للاعتراف Cas9. لتشكيل مجمع GRNA، قم بدمج الحمض النووي الريبي CRISPR والRNA المتتبع في مخزن TE المؤقت وفقًا لاتجاهات المخطوطات، وذلك للتركيز الدوبلوج النهائي لـ 44 ميكرومولار.
احتضان الخليط في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق والسماح لها لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. تمييع نوى Cas9 المؤتلف مع PBS لتركيز النوى النهائي من 36 ميكرومولار. ثم اخلطي حجمًا متساويًا من النيوكلاز المخفف مع كل من الدوبليكس GRNA وحضنها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لمجمع RNP بالتشكل.
جهاز طرد مركزي 2.5 مليون خلية في أنبوب 1.5 ملليلتر في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق. ثم تجاهل عظمى وإعادة تعليق الخلايا في 163 ميكرولترات من 1640 1640 1640 متوسطة دون الفينول الأحمر. إضافة 16.7 ميكرولترات من مجمع RNP و 3.6 ميكرولترات من 100 محسن كهربائي micromolar إلى الخلايا ونقل الخليط إلى 0.2 سنتيمتر الفجوة الكهربائية cuvette، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات.
الكهربائي الخلايا ونقلها إلى قارورة ثقافة الأنسجة T-25 التي تحتوي على 6 ملليلتر من كامل 1640 1640 1640. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد يوم واحد من الكهربة، قم بتخفيف الخلايا إلى 5000 خلية لكل ملليلتر في 1640 دقيقة كاملة.
وإضافة 100 ميكرولترات من تعليق الخلية في كل بئر من 96 بئرا النسيج لوحة الثقافة. زراعة الخلايا لمدة سبعة إلى 14 يوما ثم استخراج الحمض النووي الجينوم باستخدام نظام تنقية عالية الإنتاجية. إضافة 100 ميكرولترات من لوحة ملزمة وتحلل العازلة إلى كل بئر من لوحة استخراج 96 جيدا، تليها 50،000 الخلايا إعادة تعليق في 10 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.
خلط محتويات جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للحمض النووي الجينومي لربط الآبار. ثم pirate بعناية الحل من الآبار وغسلها مع 120 ميكرولترات من العازلة الغسيل.
الهواء يجف الصحن إضافة 20 ميكرولترات من مزيج PCR إلى كل بئر وتشغيل PCR وفقا لاتجاهات المخطوطات. بمجرد اكتمال التضخيم، قم بتقدير كمية المنتج عن طريق قياس تركيز عدد مختار من العينات باستخدام مقياس الفلور.
تخفيف جميع العينات إلى 0.5 نانوغرام لكل ميكرولتر مع نواة المياه الحرة. مزيج ميكرولتر واحد من المنتج PCR المخفف مع 8.5 ميكرولترات من الفورماميد deionized و 0.5 ميكرولترات من معيار حجم الفلورسنت صبغ المسمى في 96 جيدا بلات متوافق مع محلل الوراثية. غطي الطبق بطبقة سيبتا وسخ العينات عند درجة 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق في دراجة حرارة.
إجراء كهرباء شعرية لفصل المنتجات PCR المسمى وتحليل النتائج على برنامج التحليل. تحقق من رمز برتقالي لعرض الأجزاء المسماة ومستوى الحجم لتقييم جودة استدعاء الحجم. ثم، تحقق من الرمز الأزرق لعرض منتجات PCR المسماة.
تحديد القمم المطابقة للمنتجات البرية والمتحولة وتقدير مستوى المتحول في كل عينة عن طريق تقسيم المنطقة تحت الذروة المتحولة حسب مجموع المنطقة تحت القمم البرية والمتحولة. حدد تجمعات الخلايا المتعددة مع مستويات عالية من الحذف المتوقع لمزيد من التخفيفات التسلسلية. كرر استخراج الحمض النووي، وPCR الفلورسنت، وخطوات الكهرباء الشعرية واختيار المستنسخين مع مستويات متحولة أكبر من 95٪ للتحليل اللاحق.
استخراج RNA مجموع من المستنسخين المختارين وتنفيذ تخليق الحمض النووي مجانا. اخلطي الحمض النووي الريبي مع التمهيدي المتعدد T و dNTPs وفقًا لاتجاهات المخطوطات وحضن في درجة 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، ضع رد الفعل على الجليد لمدة دقيقة واحدة على الأقل.
إضافة عشرة microliters من مزيج التوليف cDNA إلى رد الفعل. ثم احتضان العينة في 50 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة و 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق في دراجة الحرارة. بعد التوليف cDNA، علاج العينات مع ميكرولتر واحد من RNase H واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
تصميم التمهيدية و TaqMan تحقيقات على وجه التحديد للتباين نسخة الفردية التي تم إنشاؤها من المروجين البديلة واستنساخ شظايا الحمض النووي التي تحتوي على تسلسلات نسخة محددة في الحمض النووي plasmid. جعل سلسلة التخفيف عشرة أضعاف من plasmids المؤتلفة والمنحنيات القياسية لتكميم النص. إعداد 20 ميكرولترات من مزيج PCR لكل عينة وتشغيل PCR في الوقت الحقيقي وفقا لاتجاهات المخطوطات.
تحليل النتائج وتطبيع عدد نسخة من النصوص المستهدفة في كل عينة مع جين التدبير المنزلي. وقد تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لحذف كاتم الصوت في ترونيك RUNX1 وتم تأكيد الحذف مع الكهربائي هلام الشعيرات الدموية. الأحجام المتوقعة من المنتجات البرية من النوع وPCR متحولة حوالي 500 أزواج قاعدة و 230 أزواج قاعدة على التوالي.
حجم المنتجات المتحولة يمكن أن تختلف بين المستنسخين بسبب indels التي تشكلت في مواقع الانقسام. تم استخدام تسلسل السانجر لتأكيد هوية الحذف. الجين RUNX1 يحتوي على اثنين من المروجين، P1 و P2 التي أنتجت ثلاثة نسخ رئيسية من الميرنا: RUNX1c بواسطة P1، و RUNX1a و RUNX1b بواسطة P2. يمكن استخدام PCR الكمية في الوقت الحقيقي لتحديد كيفية تأثير حذف عنصر كاتم الصوت على التعبير عن هذه النصوص.
تصميم جيد من RNAs CRISPR مهم لتقييمها للتجربة. تأكد من أن يتم حزم RNA CRSIPR بشكل وثيق إلى منطقة الحذف المقصودة. أيضا، ضمان من تسلسل PAM يقع في اتجاه المصب من التسلسل المستهدف للتعرف على Cas9.
وبصرف النظر عن دراسة CREs، يمكن استخدام هذه الاستراتيجية لدراسات موقع الجينات، وتعمل كبديل لتدخل الحمض النووي الريبي لفحص وظائف الجينات. من خلال الجمع مع تقنيات التقاط التشكل الكروموسومي CRISPR سيساعد بالتأكيد فك تورط CREs في منظمة الجينوم المتغيرة والتعبير الجيني المرتبط بمشاكل صحية مختلفة مثل السرطان.
