يسلك هذا البروتوكول فيزيائية الأمراض المضادة للمقارنة للغاية من التليف كرون في الإنسان ويناقش أيضا الآثار المثبطة بوساطة راباميسين على التليف المعوي. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه يصف تطور التليف المعوي في فترة قصيرة جدا من الوقت تتراوح بين أربعة وثمانية أسابيع، مما يتيح لنا الفرصة لدراسة إصلاح الأنسجة وتجديد الأنسجة. هذا البروتوكول سوف تكون مفيدة للباحثين الذين هم في عجلة من امرهم للحصول على آلية التليف، وتساعد على العثور على أفضل التكنولوجيا للتنبؤ التدخل للتليف المعوي كرون المرتبطة.
لبدء هذا الإجراء، حلق الفئران البالغة حول منطقة الرقبة من أجل ما قبل توعيتهم لـ TNBS عن طريق التعرض لجلدية. ثم نقع مسحة كوتون مع TNBS وتطبيقه على منطقة حلق من عنق الماوس. ثمانية أيام بعد التوعية، والحث على التهاب القولون من قبل الإدارة داخل 1000 مرة في الأسبوع، لمدة ستة أسابيع.
للقيام بذلك، تطبيق أربعة ملليغرام من TNBS في 25٪ الإيثانول باستخدام حقنة 100 ميكرولتر عن طريق حقنة ملليلتر واحدة تعلق على إبرة غوفاج الصلب. إعطاء الفئران السيطرة 100 ميكرولترات من 25٪ الإيثانول فقط. بعد تخدير الفئران ، حقن داخل الصفاق إما rapamycin في اثنين ملليغرام في اليوم الواحد ، أو سيارة ، أو كليهما ، كل يوم من أيام الأسبوع لمدة ثلاثة إلى ستة أسابيع لكل من السيطرة والفئران المعالجة TNBS.
بعد ذلك ، استخدم أمعاء الفئران المعالجة بعد ستة أسابيع لتحليل الأمعاء خارج الخلية. أولاً، افتح القولون طولياً في الجليد البارد HBSS وغسل القولون في HBSS. باستخدام مقص معقمة، وقطع القولون إلى قطع صغيرة التي هي ما يقرب من خمسة سنتيمترات في HBSS.
نقل قطع أنسجة القولون الصغيرة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من العازلة قبل الهضم. هز الأنبوب في 100 دورة في الدقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، تمرير التعليق من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 40، والتخلص من ظهارة القولون المرفقة.
جمع الأنسجة المتبقية من مصفاة وهضمها كذلك في عازلة الهضم التي تحتوي على الكولاجين من النوع الرابع وNADSE1 في 1X HBSS مع 5٪ FBS لمدة 20 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 100 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، دوامة الأنسجة المهضومة لمدة 20 ثانية تقريبا وتمريرها من خلال مصفاة خلية ميكرومتر 40 للحصول على كسور بروبريا لامينا. الطرد المركزي الكسور بروبريا لامينا في 700 مرة G وأربع درجات مئوية إلى بيليه أسفل الخلايا.
ثم، جعل 100 ملليلتر من كل من 30٪ و 70٪ حلول وسائط التدرج الكثافة. Resuspend الخلايا التي تم الحصول عليها في 10 ملليلتر من 30٪ حل وتراكب هذا على رأس خمسة ملليلتر من 70٪ حل في أنبوب 15 ملليلتر. الطرد المركزي التدرج في حالة كسر الحرة في 1،000 مرة G ودرجة حرارة الغرفة.
جمع مرحلة حلقة بيضاء تحتوي على الخلايا الليمفاوية بروبريا لامينا، والتي ستكون بين 30٪ و 70٪ طبقات التدرج. غسل الخلايا التي تم الحصول عليها عن طريق إعادة تعليقها في الجليد البارد HBSS والطرد المركزي في 500 مرة G و 10 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS.
قبل تلطيخ الأجسام المضادة ، كتلة الأولى سطح الخلية من خلايا بروبريا لامينا عن طريق احتضان لهم مع المضادة للماوس CD16 من قبل مانع 32FC على الجليد لمدة 15 دقيقة. احتضان الخلايا التالية مع الأجسام المضادة المضادة CX3CR1 PE جنبا إلى جنب مع الميكروبات المضادة لPE على الجليد لمدة 30 دقيقة لالتقاط الخلايا المنضمة، ثم غسل الخلايا مع عازلة FACS. مرر الأجسام المضادة والخلايا المربوطة بخرزة من خلال عمود فرز الخلايا المغناطيسية المنشطة في المجال المغناطيسي لإزالة الخلايا غير المنضمة.
اغسل الخلايا ثلاث مرات بمخزن FACS. بعد ذلك، قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي ودفع المكبس في العمود إلى إنتاج الخلايا المقيدة بالخرز. أولا، منع الخلايا بروبريا لامينا مع CD16 المضادة للماوس من قبل مانع 32FC على الجليد.
سلالة الخلايا عن طريق احتضان مع المضادة CD64، CD11c، CD11b، CX3CR1، Ly6C و MHC الفئة الثانية الأجسام المضادة ثم فرز الخلايا باستخدام جهاز قياس تدفق FACS كما هو موضح في بروتوكول النص. Lyse الخلايا التي تم فرزها لإعداد الحمض النووي الريبي الكلي والكشف عن علامات السيتوكين والليفية. تحليل التعبير مرنا من علامات ليفية وتحليل السيتوكين الالتهابي من تعليق خلية واحدة معزولة من تنقية المغناطيسي.
لبدء تلطيخ سطح الخلية والتحليل، resuspend بين 500، 000 و 1 مليون خلية لامينا المعزولة بروبريا في 15 ملليلتر من العازلة FACS. احتضان الخلايا مع المضادة لـ CD16 من قبل 32 الأجسام المضادة في تخفيف من 1 إلى 50 على الجليد لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا بـ 500 ميكرولترات من عازلة FACS الباردة لإزالة الأجسام المضادة غير المنضمة.
سطح وصمة القولونية تعليق خلية واحدة مع الأجسام المضادة الفلورية المسمى في تخفيف من 1 إلى 100 على الجليد لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا المسماة مرتين لإزالة الأجسام المضادة غير المنضمة باستخدام 500 ميكرولترات من عازلة FACS الباردة للجليد لكل غسل. ثم قم بتحليل الخلايا أحادية النوى المسماة بواسطة مقياس تدفق الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص.
لبدء تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا وتحليلها، استخدم مجموعة حل التثبيت من أجل إصلاح الخلايا الملطخة بالسطح و permeabilizeize وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بوابة الخلايا بروبريا لامينا كما هو مبين في بروتوكول النص للكشف عن مستوى داخل الخلية من اي إل-1 بيتا سيتوكين. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا عن طريق إضافة المخزن المؤقت للفاكسات والطرد المركزي بمعدل 200 مرة من G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق لإزالة الحاجز الزائد.
كرر هذا الغسيل مرة واحدة. لتحديد مستوى ألفا العضلات الملساء actin، أولاً permeabilize الخلايا مع مجموعة حل التثبيت permeabilization. احتضان الخلايا مع المضادة ألفا SMA اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة في تخفيف من 1 إلى 1000 على الجليد لمدة 30 دقيقة.
ثم غسل الخلايا عن طريق إضافة العازلة FACS وsuguging في 200 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق لإزالة العازلة تثبيت الزائدة. كرر هذا الغسيل مرة واحدة. إجراء تحليل FACS وبوابات الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص.
في هذه الدراسة يتم اعتماد نموذج الماوس التهاب القولون TNBS لدراسة وتوضيح الآليات الكامنة من التليف المعوي. بعد ستة أسابيع من العلاج TNBS، يمكن ملاحظة أن طول القولون تقصير تدريجيا على مدى العلاج TNBS من حوالي خمسة سنتيمترات في مجموعة التحكم إلى ما يقرب من ثلاثة سنتيمترات في مجموعة TNBS. لضمان نموذج مرض TNBS Crohn مشابه لنموذج التليف البشري في كرون وليس قطعة أثرية تتعلق بالمنهجية ، يتم تحليل العلامات الليفية على مستويات متعددة في دراسة مفصلة.
تراكم ألفا العضلات الملساء actin الخلايا الإيجابية وترسب الكولاجين داخل طبقات تحت المخاطية وقد تم الإبلاغ في معظم حالات التليف ويعتبر سمة مميزة للأحداث الليفية لمقارنة TNBS التليف مع التليف المرتبطة كرون، ويتم تحليل التعبير عن علامات التليف والسيكوكاينات في خزعة الأنسجة الطازجة من ileum المرضى الذين يعانون من CD نشطة أو تحت مغفرة. بشكل ملحوظ, وينظر إلى الحث ملحوظ من سماكة ألفا العضلات الملساء actin الطبقات الإيجابية وزيادة ترسب الكولاجين في أقسام مؤتمر نزع السلاح النشط. يتم إجراء تحليل البقعة الغربية لتأكيد تحريض ألفا التعبير العضلات الملساء actin في عينات القرص المضغوط النشطة.
وبالإضافة إلى ذلك، يتم الكشف عن تحريض كبير من علامات التليف عن طريق تحليل qPCR. ثم يتم تقييم آثار راباميسين، وهو مثبط دوائي لنشاط M4 لتحديد آلية للحد من التليف TNBS. يتم التعامل مع الفئران مع كل من TNBS و rapamycin ومستويات ألفا العضلات الملساء actin ويتم تحليل الكولاجين في الأنسجة القولون.
من المهم أن نتذكر لتطعيم نفس المبلغ من TNBS لكل ماوس ومعالجة عزل خلايا بروبريا لامينا في أقرب وقت ممكن لتجنب فقدان الخلايا وكذلك للحفاظ على صلاحية الخلية. تفاصيل بروتوكول لدينا على التليف TNBS ومغفرة من التليف وكذلك عامل مثبطة من راباميسين في تكوين التليف. قد يكون الباحث الآخر مهتمًا باستخدام هذه التقنية للعثور على هدف أفضل للأدوية للتليف وسرطان القولون.
يرجى تذكر أن TNBS هو مصدر تهيج الجلد وينبغي ارتداء معاطف المختبر أثناء التعامل مع لتجنب ملامسة الجلد.
