وتوفر هذه الطريقة معلومات عن آثار العلاج المعتمد على دورة الخلية وتسمح بدراسة متعمقة للتفاعل بين الانتشار الخلوي وآليات التكيف ضد تلف الحمض النووي. هذه الطريقة تجمع بين نقاط النهاية الهامة من الاستجابة لتلف الحمض النووي بما في ذلك التعرف على الخيط المزدوج وإصلاحها ، وتأثيرات دورة الخلية ، وموت الخلايا في نهاية المطاف عن طريق المبرمج في فحص شامل واحد. لقد استخدمنا هذه التقنية بشكل رئيسي للتحقيق في استجابات علاجية محددة والآثار الجانبية للعلاجات الإشعاعية في الأورام السريرية.
التشايس مفيد جدا للدراسات المرتبطة في مجالات البيولوجيا الإشعاعية والعلاج الإشعاعي، ولكن يمكن أيضا أن تطبق على مختلف المجالات الأخرى للأورام. بعد جمع الخلايا من الثقافة وفقا لإجراءات جمع الخلية القياسية، resuspend بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. ونقل الخلايا إلى مليلترين من حل التثبيت في غطاء محرك السيارة.
بعد 10 دقيقة حضانة في درجة حرارة الغرفة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وdedeant اهب. من المهم إصلاح الخلايا كـ تعليق خلية واحدة، والاحتفاظ باستمرار وقت التثبيت لكافة العينات. إعطاء الخلايا المنضمة ما يكفي من الوقت لفصل للحصول على خلايا مقربة لطيف للتحليل.
ثم تخفيف بيليه عن طريق التنصت وإعادة تعليق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من 70٪ الإيثانول. لغسل الخلايا قبل تلطيخ، رواسب الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وتخفيف بيليه عن طريق التنصت. ثم إعادة تعليق الخلايا مع اثنين من يغسل متتالية مع ثلاثة ملليلتر من محلول الغسيل وغسل واحد مع ملليلتر واحد من محلول الغسيل.
التخلص من المابير بين كل غسل. بعد الغسيل الأخير ، pirate بعناية عظمى دون إزعاج بيليه و resuspend بيليه لوسينت في 100 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة من الفائدة. بعد ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وpirate بعناية عظمى دون إزعاج بيليه.
ثم، resuspend بيليه خففت في 100 إلى 250 ميكرولترات من الحمض النووي تلطيخ الحل والاستغناء عن الخلايا من خلال غطاء مصفاة الخلية من أنبوب عينة مع حجم مسام شبكة 35 ميكرومتر. لتحليل الخلايا بواسطة قياس التدفق، افتح علامة تبويب المعلمات في نافذة مقياس الخلايا وحدد المعلمات كما هو مشار إليه في الجدول. بعد ذلك، افتح إطار ورقة العمل ثم إنشاء مخططات كما هو مبين.
قم بتحميل عينة تحكم على مقياس السيتومي ثم اضغط على زر التشغيل. حدد الأنبوب الأول في نافذة المتصفح وانقر على اسم الأنبوب. ضبط الفولتية للكشف عن الجانب الأمامي والجانب مبعثر وDAPI في علامة التبويب المعلمات من نافذة المفتش.
اضغط على زر الاستعداد للمتابعة مع إعداد ورقة العمل في البرنامج. استخدم أداة بوابة المضلع لتعريف الخلايا'السكان في منطقة التشتت الأمامية مقابل رسم ناحية التشتت الجانبي واستخدام أداة بوابة المستطيل لتعريف مجموعة الخلايا المفردة في DAPI مع رسم منطقة DAPI مقابل. اضغط على التحكم G لإظهار التسلسل الهرمي للفئات السكانية وانقر على أسماء البوابات الافتراضية لإعادة تسميتها.
في وقت لاحق ، انقر بزر الماوس الأيمن على جميع المدرجات التوضيحية لتحديد مجموعات السكان والخلايا الفردية من قائمة السياق. الحصول على عينات التحكم والمعالجة لتحسين الفولتية للكشف عن الفلوروفوريس ذات الأجسام المضادة إلى تغطية مجموعة ديناميكية كاملة من إشارة. لقياس العينات، اضغط على زر التشغيل على مقياس المقاييس واستخدم لوحة التحكم في الاكتساب في البرنامج لقياس العينات.
ثم حدد ملف وتصدير والتجارب لتحديد تصدير الدليل في مربع الحوار لحفظ البيانات كملفات نقطة FCS. لتقييم البيانات، اسحب وإفلات الملفات نقطة FCS في مستعرض عينة من تدفق برنامج التحليل cytometric. واستخدام أداة المضلع لتحديد الخلايا'السكان في الأمام مقابل الجانب مخطط منطقة التشتت واستبعاد الحطام من التحليل.
في رسم مساحة DAPI مع مقابل DAPI، استخدم أداة المستطيل لتعريف مجموعة الخلايا المفردة واستبعاد أي مزدوجة أو كتل من التحليل. في الرسم البياني لمنطقة DAPI، استخدم أداة البيكتور للتمييز بين الخلايا المفردة ذات محتوى الحمض النووي العادي من الخلايا المبرمجة ذات الحمض النووي المتدهورة. حدد أداة البيولوجيا ودورة الخلية لفتح أداة نموس دورة الخلية وحدد عميد- جيت فوكس لتقدير تردد الخلايا في G واحد S و G اثنين M مراحل.
إنشاء G واحد S و G اثنين و M البوابات المرحلة في DAPI مع رسم منطقة DAPI مقابل من السكان دورة الخلية لتمكين دورة خلية محددة جاما H اثنين قياس X. استخدم أداة البيزان للتمييز بين phosphohistone H ثلاث خلايا إيجابية وسلبية في الرسم البياني لمنطقة Alexa 555 للسكان دورة الخلية وللتمييز بين CAS ثلاثة خلايا موجبة وسلبية في الرسم البياني لمنطقة Alexa 647 للسكان الخلايا المفردة. اضغط على عنصر التحكم T لفتح محرر الجدول وتكوين الجدول كما هو مبين.
ثم حدد إلى ملف لتعيين التنسيق والوجهة في قسم الإخراج من شريط القائمة وتصدير البيانات إلى ورقة انتشار. أيونات الكربون تحفز ارتفاع غاما H اثنين من مستويات الذروة AX في خلايا الورم الأرومي الدبقي التي تنخفض ببطء أكثر وتظل مرتفعة بشكل كبير في 24 إلى 48 ساعة مقارنة مع الإشعاع الفوتون في نفس الجرعة المادية. لكل من أيونات الكربون والإشعاع الفوتون، كانت درجة غاما H مستويين AX الأعلى في خلايا G المرحلة الأولى على الأرجح لأن إصلاح كسر الخيط المزدوج للحمض النووي يقتصر على مسار عدم ربط nonhomologous في هذه المرحلة في دورة الخلية.
تمشيا مع ارتفاع معدل التعريفي كسر حبلا مزدوجة وحركية إصلاح أبطأ، أيونات الكربون تحفز أقوى وأطول أمدا القبض دورة الخلية في مرحلة G اثنين ومعدل أعلى من المبرمج أكثر من الفوتونات. اعتمادا على قوة تأثير العلاج، يمكن أن يكون قرار مراحل دورة الخلايا المختلفة تحديا. في بعض خطوط الخلية، تركيز DAPI له تأثير كبير على جودة ملف تعريف دورة الخلية ويحتاج إلى تعديل.
يمكن إعداد الشرائح من العينات المتبقية بعد تدفق قياس الشقوق لتقييم عدد وحجم وشكل غاما H اثنين من أكس foci والتمييز بين البؤري وparnuclear غاما H اثنين من تلطيخ AX. باستخدام طريقتنا، يمكننا أن نظهر أن الخلايا الجذعية الميسنشية مقاومة نسبيا ضد الإشعاعات المؤينة وتثبيط توبواomerase ولكن حساسة للجليومياس. كما أبخرة PFA هي سامة، دائما استخدام غطاء محرك الدخان عند إعداد حل التثبيت وأثناء خطوة التثبيت.
تذكر أيضا أن ارتداء القفازات عند التعامل مع DAPI.
