خلايا العضلات الملساء detrusor تشكيل جدار المثانة التي تسهل في نهاية المطاف البول الفراغ والتخزين. بروتوكول لدينا يوفر طريقة موثوق بها وموثوق بها لعزل حديثا من خلايا العضلات الملساء واحدة. خلايا العضلات الملساء المُعزلة حديثاً للبشر توفر فرصة للفحص الكهربائي والفيزيائي على مستوى الخلية الواحدة.
من خلال دراسة خلايا العضلات الملساء أحادية الانسانية من السيطرة ، والمثانات البولية البشرية العادية والمريضة ، لدينا الفرصة للتحقق من صحة الأهداف الدوائية مثل القنوات الأيونية. خلايا العضلات الملساء أحادية الجسم البشري هي مثالية للتجارب الكهربائية الفيزيولوجية مثل الفيزيولوجيا الكهربائية المشبك. هنا سوف نقدم مثالا لدراسة قناة أيون واحد اسمه TRPM4، مستقبلات عابرة melastatin أربع قنوات، وهو قناة الموجبة غير انتقائية.
قد يعاني المبتدئون من خطوات التسلخ والعلاج الأنزيمي التي تتطلب الكفاءة والألفة بما في ذلك التعرف على الخطوات الهامة الحاسمة للحصول على خلايا DSM المعزولة الجديدة. من المهم أن تكون على دراية بأنستولوجيا المثانة البشرية ، والخطوات البروتوكولية لعزل الخلايا الفردية تبقى مرنة ، وتتوقع في البداية الحصول على خلايا دون المستوى الأمثل باستخدام هذا البروتوكول. تبدأ بفحص كامل سمك عينة المثانة البولية.
دبوس العينة، الغشاء المخاطي التي تواجه صعودا وسيروزا أسفل على طبق سيليكون المغلفة enantiomer جولة 150 ملم مليئة الجليد الباردة DS وإزالة بعناية كل من الغشاء المخاطي عن طريق تشريح حاد. قطع العديد من الغشاء المخاطي خالية detrusor العضلات الملساء أو قطع DSM. ضع ثلاث إلى ست قطع DSM في أنبوب مع ملليلتر واحد إلى ملليلتر من DS مسبقًا التي تحتوي على papain و dithiothreitol ، أو DS-P.
احتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 45 دقيقة، مع التأكد من هز أنبوب كل 10 إلى 15 دقيقة. بعد الحضانة، وإزالة DS-P من الأنبوب وغسل لفترة وجيزة القطع DSM مع الجليد الباردة DS. نقل DS مع قطع DSM إلى أنبوب جديد وإزالة DS، وترك القطع DSM في الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة واحد إلى ملليلتر من DS التي تحتوي على نوع الكولاجين الثاني، أو DS-C، إلى الأنبوب.
واحتضانه في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في بعض الأحيان. تخلص من DS-C واغسل قطع DSM المعالجة بالانزيم خمس إلى 10 مرات مع الجليد البارد DS. بعد الغسيل الأخير ترك DS داخل الأنبوب، و triturate بلطف القطع مع ماصة باستور مصقول النار لإطلاق سراح خلايا DSM واحد. Pipette 0.25 إلى ملليلتر واحد من تعليق الخلية على غرفة أسفل الزجاج يجلس على خشبة المسرح من المجهر المقلوب واحتضانه لمدة 45 دقيقة على الأقل للسماح للخلايا بالتمسك.
ثم, إزالة DS من الحمام واستبداله بحل E عبر القذف الفائق. سحب أقطاب التصحيح متعددة، وطلاء النار نصائح القطب، ومعطف النصائح في شمع الأسنان إذا لزم الأمر. املأ طرف قطب التصحيح مع محلول الماصات بدون الأمفوتريسين-B عن طريق غمس القطب لفترة وجيزة في الحل.
نجاح التصحيح المشبك الفيزيولوجيا الكهربائية يعتمد على جودة الخلية DSM وmubilization amphotericin-B. قم بتلمير القطب مع نفس المحلل الماصات الذي يحتوي على الأمفوتيريسين-B و جبل القطب على حامل متصل بمضخم مضخم مضخم رقعة. استخدام ميكرومانيبولاتور لوضع القطب أسفل سطح الحل خارج الخلية بحيث يتم غمر فقط غيض من القطب.
ثم، تحديد مقاومة القطب باستخدام وظيفة نافذة اختبار الغشاء من البرمجيات اقتناء التجارية وتقدم القطب نحو الخلية من الفائدة. عند لمس سطح الخلية مع القطب الكهربائي، تشكل جيجا الختم عن طريق تطبيق ضغط سلبي سريع لطيف إلى القطب عن طريق الأنابيب. وهذا يؤدي إلى الضغط السلبي في غيض من القطب مما أدى إلى نجاح جيجا الختم كما أكد من قبل اختبار الغشاء.
السماح 30 إلى 60 دقيقة ل amphotericin-B لنشر أسفل الماصة ويتم إدراجها في غشاء البلازما, تشكيل المسام انتقائية في المقام الأول إلى أحادية التكافؤ الكاتيونات. مواصلة رصد جيجا ختم مع وظيفة اختبار الغشاء. عندما تكون إنثقاب التصحيح الأمثل، قم بإلغاء العابرين بالسعة عن طريق ضبط الأوجه للسعة الخلوية ومقاومة السلسلة على مكبر الصوت.
بمجرد ملاحظة التيارات ثبات مستوى الجهد، تسجل التيارات مع بروتوكول خطوة الجهد التوجيه كما هو موضح في المخطوطة. تطبيق مركب أو حالة اختبار فسيولوجية لاختبار عن طريق الضخ الفائق وتسجيل الاستجابات لظروف التحكم والاختبار وكذلك الاغتسال. يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل خلايا DSM صحية وجديدة للدراسات الفنية والجزيئية.
تتميز خلايا DSM واحدة صحية من قبل مورفولوجيا على شكل المغزل، حواف واضحة واضحة المعالم، هالة محددة جيدا حول الخلية، ومظهر شبه انقبالي عندما ينظر إليها تحت المجهر. وعلاوة على ذلك، تستجيب خلايا DSM المعزولة حديثًا للتحفيز الميكانيكي والكارباخول. وينبغي تجنب شظايا الخلية والخلايا غير القابلة للحياة أو الإفراط في هضمها في التجارب اللاحقة التصحيح المشبك.
وقد استخدمت الخلايا المعزولة في amphotericin-B مثقبة التصحيح المشبك التجارب حيث تم قياس التيارات الخلية الكاملة مع إما الجهد خطوة الناجمة أو بروتوكول منحدر في ثلاث خلايا DSM الإنسان مختلفة. وكشفت التجارب أن 9-phenanthrol, المانع قناة TRPM4, بشكل فعال وعكسي تثبيط الإنسان DSM التيارات الموجبة. 9-phenanthrol الحساسة الحالي مكون يوضح تثبيط أقوى في الفولتية الإيجابية وتصحيح الخارج.
حالة خطوات العلاج الأنزيمية، والخطوات 2.2 و 2.3، بما في ذلك درجة الحرارة، ومدة العلاجات انزيم، ومصادر لوت انزيم وجودة خلايا DSM، هي المحددات الرئيسية للحصول على خلايا DSM الإنسان عالية الجودة. خلايا DSM الإنسان هي أيضا مناسبة بشكل مثالي لتقييم مستويات رسول الثانية داخل الخلايا بما في ذلك الكالسيوم وCOM دوري, الكشف عن تعبيرات البروتين عن طريق الكيمياء المناعية, والتعبير المشترك من قبل في موضعية التقاضي السحيق المقايسة, والتعبير مرنا من قبل RT-PCR, qRT-PCR, microarrays, وتسلسل الجيل القادم. وقد تقدمت خلايا DSM الإنسان فهمنا لأدوار BK, الكالسيوم, TRPM4 قنوات في المثانة.
وسوف تسمح التطورات المستقبلية بربط الخصائص الكهروفيزيائية أو الدوائية على وجه التحديد مع ملفات النص أو البروتيوم.
