معظم التجارب دراسة التفاعلات النباتية الميكروبية من خلال التركيز على الاستعمار، ولكن تم تصميم بروتوكول لدينا للنظر في كل من الاستعمار والحفاظ على البكتيريا على الجذر. يمكننا تغيير التجربة لتناسب البكتيريا والنباتات المختلفة، ويمكننا حتى اختبار البكتيريا متعددة في كل لوحة 24 جيدا. للبدء ، واستخدام ثقب القياسية اللكم لإنشاء أقراص من شبكة بلاستيكية.
جمع الأقراص في وعاء زجاجي ، وتغطية فضفاضة. تعقيم باستخدام مجموعة الأوتوكلاف لدورة جافة لمدة 20 دقيقة. استخدام ملاقط معقمة اللهب لتوزيع ما يقرب من 40 أقراص شبكة معقمة في طبقة واحدة عبر سطح المصنع المعدة سابقا نمو الصفيحة متوسطة agar.
ضع بذورين تم تعقيمهما سابقًا في مركز كل شبكة. ختم لوحة مع الشريط الجراحي، واحتضان لمدة يومين إلى ستة أيام في أربع درجات مئوية في الظلام لvernalize البذور. ثم، ضع لوحة أجار الجانب إلى أسفل في غرفة نمو النبات لمدة ثمانية إلى 10 أيام تحت إعدادات قصيرة اليوم من تسع ساعات من الضوء في 21 درجة مئوية و 15 ساعة من الظلام في 18 درجة مئوية لنبات وتنمو الشتلات.
إضافة ملليلتر واحد من نمو البكتيريا المتوسطة لكل بئر من صحن 24-جيدا معقمة. لنقل الشتلات المبتوتة جزءا لا يتجزأ من شبكة، واستخدام ملقط معقمة اللهب لتقشير بلطف شبكة تحتوي على اثنين منبات، على قدم المساواة في الحجم، وشتلات التالفة صعودا وقلاعا على لوحة أجار. نقل تعويم واحد مع الشتلات إلى كل بئر من السائل نمو البكتيريا، والجذر الجانب إلى أسفل.
المقبل, البكتيريا ريسوسينيد نمت بين عشية وضحاها على لوحات أجار في متوسط النمو البكتيري السائل. أضف 10 ميكرولترات من التعليق البكتيري إلى كل بئر ، باستثناء آبار التحكم في الوسائط فقط ، لتركيز نهائي من مليون وحدة تشكيل مستعمرة من البكتيريا في البئر. لختم لوحة للنمو العقيمة، اضغط بعناية على الغاز نفاذية الفيلم عبر لوحة دون لمس الجانب لزجة.
تطبيق الضغط حول كل من الحلقات التي أدلى بها الآبار لضمان أن كل بئر قد تم مختومة بشكل فردي. ثم، أغلق اللوحة بغطاءها البلاستيكي على الفيلم القابل للنفاذ بالغاز. ضع الصفيحة في غرفة نمو النبات على لوحة هزاز مدارية من المقرر أن تبلغ 220 دورة في الدقيقة، وحضن لمدة 18 ساعة في ظل نفس الظروف التي كانت فيها الشتلات تنبت في الأصل.
لشطف جميع العوامات بالنباتات، أضف ملليلتر واحد من الماء المعقم إلى كل بئر من لوحة جديدة من 24 بئرًا. إزالة فيلم الغاز نفاذية من لوحة مع النباتات، واستخدام ملقط العقيمة لنقل العوامات إلى الآبار بالماء، واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون تحريض. ثم، ملء كل بئر من لوحة جديدة 24-جيدا مع ملليلتر واحد من متوسطة نمو النبات.
نقل شبكة واحدة إلى كل بئر، وتغطية مع ختم الغاز نفاذية. احتضان لمدة 72 ساعة على لوحة النهاز المدارية في 220 دورة في الدقيقة في غرفة نمو النبات. بعد الحضانة ، شطف النباتات كما فعلت سابقا.
بعد الشطف، وإزالة الشتلات من شبكة عن طريق وضع بلطف ملقط معقمة اللهب تحت الأوراق على الجانب ورقة من شبكة. قرصة طفيفة الجذعية، وتذبذب الشتلات صعودا وبعيدا عن شبكة لإزاحة الجذر دون كسره. لإزالة البكتيريا من جذور النبات، نقل الشتلات من كل شبكة إلى آبار فردية من لوحة سونيكيشن 24 جيدا تحتوي على ملليلتر واحد من الماء المقطر المزدوج.
Sonicate جميع العينات داخل لوحة في وقت واحد باستخدام sonicator متعددة الأعراق كما هو موضح في المخطوطة. لتحديد كمية البكتيريا، تنفيذ التخفيفات التسلسلي 10 أضعاف من عينات سونيكاتيد في وسط النمو البكتيري. تنتشر باستخدام حبات الزجاج العقيمة، واحتضان في درجة الحرارة المثلى للبكتيريا حتى المستعمرات الفردية هي العد.
لجمع جذر النبات سليمة، واستخدام ملقط لإزالة الشتلات من شبكة. ثم، نقل كل مصنع إلى شريحة المجهر عن طريق وضع غيض من الجذر على الشريحة وسحبه بعيدا عن الطرف لتعيين اسقاط تدفق مع الشريحة، وضمان تقويم الجذر لأفضل التصوير. أضف قطرة من الماء أو نمو النبات العقيمة المتوسطة لكل عينة لترطيب الواجهات بين الأغطية والشرائح.
ضع غطاء زجاجي فوق تاج الجذر مباشرةً وتحت أوراق التصوير لتجنب ثني الغطاء، واضغط لأسفل بلطف. ثم، صورة البكتيريا باستخدام مرشحات الإثارة /الانبعاث المناسبة للتمييز بين البكتيريا من بعضها البعض والجذر النباتي. Pseudomonas simiae، بكتيريا فلورية بشكل طبيعي، استعمرت العربية ثاليانا الجذور و الحفاظ على الجذر بعد نقل إلى متوسطة نمو النبات.
تاج الجذر، منتصف الطول، وتلميح تظهر التألق بسبب استعمار سمايا Pseudomonas. السيطرة السلبية لا البكتيريا أظهرت أي استعمار. عندما تم تحديد كمي Pseudomonas simiae على أربيدبسيس ثاليانا بعد 18 ساعة من الاستعمار أو 72 ساعة من الصيانة، أظهر العدد الإجمالي للوحدات تشكيل مستعمرة لكل شتلة في أي من نقطة زمنية استنساخ جيدة عبر تكرار البيولوجية التي أجريت في أيام مختلفة.
كانت هناك زيادة في عدد وحدات تشكيل المستعمرة لكل شتلة بعد 72 ساعة في وسط الصيانة ، مقارنة بالأرقام التي لوحظت في نقطة الزمن بعد الاستعمار 18 ساعة ، مما يشير إلى أن النمو النشط للبكتيريا المستعمرة على جذر النبات حدث خلال مرحلة الصيانة. تم استخدام ثلاثة أنواع من البكتيريا المعزولة عن ثالينا العربي الذي يزرع في التربة الطبيعية في ظل ظروف مختبرية لمراقبة ارتباط الأنواع المتعددة على جذور النباتات. كانت مميزة بوضوح على وسائل الإعلام التي تحتوي على X-gal بسبب الاختلافات في مورفولوجيا المستعمرة واللون، والتي سمحت بعد وحدات تشكيل المستعمرة لكل شتلة كل نوع دون اختيار المضادات الحيوية، حتى في تربية الأنواع المتعددة.
هذه الأنواع الثلاثة من البكتيريا كانت كلها مستعمرة ومصانة على الجذر، سواء وحدها أو في زراعة البكتيريا. وأظهرت كل نوع اتجاهات متشابهة عبر تكرارات بيولوجية وتقنية مختلفة، مما يدل على أن هذا البروتوكول يمكن استخدامه لقياس كل من وحدات تكوين المستعمرات النسبية أو الكلية لكل جذر من كل نوع. عندما نمت وحدها، أي نوع الفردية أظهرت زيادة كبيرة في وفرة خلال مرحلة الصيانة، ولكن وحدات تشكيل المستعمرة الشاملة لكل جذر من المجتمع مجتمعة زادت في الثقافات المشتركة، مما يشير إلى أن هذه البكتيريا لا تحظر استعمار السلالات الأخرى.
والخطوات الأكثر صعوبة هي تلك التي تتطلب إزالة النباتات سليمة من الأقراص شبكة. أن تكون صبوراً ولطيفاً سيجعل هذا ممكناً. إذا كانت الخلايا البكتيرية الفلورسنت، يمكن فرز العينات حسب تدفق الخلايا لتحديد الأرقام النسبية للخلايا.
