لقد سبق أن قمنا بتصميم جهاز لتطبيق الضغط الميكانيكي على الخلايا المنضمة. في العمل الحالي، قمنا بإعادة تصميم هندسة الـ substratum وتخصيص الإعداد للتصوير عالي الدقة لهذه الخلايا السلالة. الميزة الرئيسية لهذا النظام تمديد الخلية هو أنه يوفر التصوير دون الخلوي عالية الدقة في 100x من الخلايا سلالة.
إثبات تلفيق الغواصات سيكون (فيكي) مساعدة أبحاث من مختبري تبدأ بتصميم قالب polydimethylsiloxane واحد جيدا باتباع طول في بروتوكول النص المرافق. المقبل، مزيج 20 أجزاء من قاعدة polydimethylsiloxane مع وكيل علاج جزء واحد في كوب المتاح.
مرة واحدة مختلطة، ووضع مزيج polydimethylsiloxane في فراغ دي غازر في 0.8 شريط لمدة 30 دقيقة لإزالة الفقاعات من هذا المزيج. ثم، صب مزيج polydimethylsiloxane في القالب والطبق. إزالة أي فقاعات إضافية في هذه المرحلة عن طريق إزالة الغاز مرة أخرى في فراغ 0.8 شريط لمدة 30 دقيقة.
عندما يكتمل إزالة الغاز، اخبز العينات عند 80 درجة مئوية على طاولة التسوية لمدة ساعتين. المقبل، وإزالة العينات بعناية من الفرن والسماح لهم تهدئة إلى درجة حرارة الغرفة. قطع حواف مع شفرة وقشر بلطف خارج polydimethylsiloxane الشفاء.
على 150 ملليمتر قطرها polydimethylsiloxane ، رسم سنتيمترين في اثنين من الشبكة سنتيمتر مع علامة. داخل كل مربع، رسم سنتيمتر واحد في سنتيمتر واحد مربع، وترك هامش من 0.5 سنتيمتر على جميع الجوانب. استخدم شفرة لقطع بعناية على طول الخطوط والحصول على مقصورات مربعة.
بعد ذلك، قم بتنظيف العينات عن طريق احتضانها في 100٪ من الأسيتون لمدة أربع ساعات، 100٪ إيثانول لمدة أربع ساعات إضافية، ثم في الماء المُقلَف لمدة أربع ساعات. ضع العينات النظيفة على ورق دعم فيلم البارافين داخل طبق بلاستيكي قطره 150 ملليمتر وجفف العينة في فرن درجة مئوية 80 لمدة أربع ساعات. عند الانتهاء، ختم الأطباق مع فيلم البارافين وتخزينها في غرفة باردة حتى مزيد من الاستخدام.
إعداد الخلايا السلف وتعليقها في وسط الانتشار. بذور هذه الخلايا في كثافة 35،000 خلية في سنتيمتر مربع على الأسطح البلاستيكية المغلفة PDL. ضبط حجم الانتشار المتوسط إلى ثلاثة ملليلتر لكل عشرة سنتيمترات مربعة من مساحة السطح.
قد يؤدي انخفاض حجم الوسائط إلى تكتل الخلايا ، الناتج عن قوى التوتر السطحي ، في حين أن حجمًا أكبر من الوسائط في الأطباق قد يتسبب في تسرب الوسائط. في اليوم الثالث بعد البذر، حصاد الخلايا وعدها باستخدام مقياس الهيموسيت. ثم، البذور 35،000 خلية في لوحة بوليديميثيلسيلوكسيان مع 700 ميكرولترات من متوسطة الانتشار.
بعد ذلك، أضف بناء بلازميك لوضع علامات على مجمعات H2B في الحجر الهاستون في الخلية مع البروتين الفلورسنت الأخضر باتباع تعليمات الشركة المصنعة. بعد 24 ساعة، قم بتركيب عينات بوليديميثيلسيلوكسيان مع الخلايا التي تمتد على جهاز السلالة الأحادية. ثم، تغيير الوسيطة في كافة العينات إلى الوسيطة التمايز.
قياس طول مقصورة الخلية غير المدربة وتحويل المسمار ميكرومتر المرحلة لزيادة طول حجرة الخلية من قبل المبلغ المطلوب من سلالة. اترك عينات البوليديميثيلسيلوكسين المتمددة وغير الممدودة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى التصوير. إعداد حاضنة المجهر للتصوير الحي من خلال تحديد درجة حرارة الحاضنة إلى 37 درجة مئوية.
المقبل، وجلب 100x هدف الغمر النفط إلى الموقف المركزي، كما turnit الهدف لن يكون الوصول إليها في وقت لاحق. مرة واحدة في موقف، فك الهدف والمسمار مرة أخرى جنبا إلى جنب مع حلقة الهدف، بحيث يمكن تحقيق الهدف أقرب إلى الخلايا. ثم، إضافة قطرة من النفط إلى الهدف.
باستخدام حامل مطبوع حسب الطلب، اغطي الحامل بالشحوم الفراغية في محيط النافذة ووضع غطاء زجاجي سُمك عدد صفر على السطح العلوي من الحامل. الشريط نافذة من البلاستيك على مرحلة المجهر. بعد ذلك، المسمار مرحلة الترجمة Z على مرحلة المجهر ونقلها إلى أعلى Z الموقف.
إزالة 500 ميكرولترات من المتوسط من لوحة البوليديميثيلسيلوكسيان امتدت لتكون صورة، وإضافة هذا المتوسط على غطاء الزجاج في نافذة من البلاستيك الأبيض. ثم استخدمي ملاقط معقم لفصل المقصورة المربعة بعناية عن لوحة بوليديميثيل سيلوكسان. عقد جهاز سلالة في وضع مستقيم بحيث تواجه الخلايا لأعلى، فوق نافذة بلاستيكية بيضاء وعكس بعناية جهاز سلالة، وذلك للسماح لأي انخفاض متوسطة اضافية مباشرة في منتصف غطاء الزجاج مع الخلايا التي تواجه لأسفل.
ضع الجزء السفلي من الجهاز الإجهاد على مرحلة الترجمة Z باستخدام الشريط على الوجهين لعقد في مكان. بينما تبحث من خلال العدسة تحت حقل مشرق، ببطء شديد جلب الجهاز سلالة أسفل ونقل الهدف حتى التركيز على الخلايا. تنفيذ هذه الخطوة التركيز ببطء، بالتناوب بين خفض مرحلة الترجمة Z ورفع الهدف.
إذا كانت مرحلة الترجمة Z يخفض كثيرا، يمكن ضغط الخلايا وبالتالي يموت. إذا رفعنا الهدف عاليا جدا، فإنه يمكن كسر غطاء الزجاج وتسبب المتوسطة لتسرب. مسح لوحة polydimethylsiloxane في الاتجاهات X و ص للعثور على الخلية التي لديها نواة الفلورسنت، وذلك باستخدام epiflorescence في 488 نانومتر الإثارة.
تأكد أيضاً من أن الخلية لديها مورفولوجيا مناسبة عند النظر إلى العينة تحت حقل مشرق. سجل صور واسعة النطاق أو مفتوحة الفتح للنواة مع 488 نانومتر من الإثارة الطول الموجي وللخلية مع استثارة حقل مشرق على فترات 30 ثانية لكل إطار لمدة إجمالية لا تقل عن 30 دقيقة. الهندسة المعاد تصميمها من substratum polydimethylsiloxane وإعداد التصوير هو مبين في هذا الفيديو يقلل من المسافة بين الخلايا والهدف.
وهذا يتيح التصوير الفاصل الزمني لخلايا الخلايا المسماة بالفلورسنت باستخدام هدف غمر الزيت 100x. لقياس التقلبات النووية، أولاً، قم بمؤامرة المنطقة النووية مقابل الوقت. ثم، detrend البيانات باستخدام متعدد الحدود من أجل ثالث.
وأخيرا، مؤامرة التقلبات المتبقية وحساب الانحراف المعياري للتقلبات المتبقية. التقلبات النووية للخلايا السلف oligodendrocyte، بعد التعريفي الكيميائي من التمايز مع وبدون سلالة الشد 10٪، تبين أنه مع التعريفي الكيميائي وحده، فإن اتساع التقلبات النووية أظهرت انخفاضا كبيرا في 48 ساعة، ولكن ليس في 24 ساعة. من ناحية أخرى، الحث الكيميائي جنبا إلى جنب مع 10٪ من الشد أظهرت انخفاض كبير في 24 ساعة، والتي ظلت ثابتة دون مزيد من الانخفاض في 48 ساعة.
أهم شيء يجب تذكره هو أن مسافة العمل للهدف المختار يجب أن تكون مساوية أو أكبر من عمق حجرة الخلية بالإضافة إلى سمك الغطاء. ويمكن إعادة تصميم substratum لتشمل الشبكة ، والتي من شأنها أن تسهل التصوير الخلية نفسها قبل وبعد تطبيق سلالة ، منذ قبل وبعد نوع من مجموعة البيانات يقلل من الضوضاء القادمة من خطأ تجريبي. باستخدام هذا الإعداد التصوير، يمكن تصوير العديد من الظواهر دون الخلوية داخل الخلايا الحية المنضمة، مثل توطين البروتين أو ديناميات المكونات الخلوية، في غضون ثوان من تطبيق السلالة الميكانيكية.
