وقد زاد هذا البروتوكول GENotyping MLB إلى حد كبير فهمنا لعلم الأوبئة وهيكل السكان العالمي من Yersinia ruckeri، وهي بكتيريا مسببة للأمراض الأسماك الهامة دوليا. بالمقارنة مع المخططات التي أنشئت سابقا Yersinia روكيري الكتابة، فإنه يقدم دقة سلالة عالية جدا. الإجراء بسيط ورخيص، وجوائز النتائج المحمولة التي يمكن مقارنتها بسهولة عبر المختبرات.
هذه التقنية يحسن إلى حد كبير خصوصية التشخيص وتمكن من تتبع العدوى. على سبيل المثال، يمكننا الآن في كثير من الأحيان التمييز بين استنساخ Yersinia ruckeri الخبيثة القائمة على خلفية سلالات بيئية غير خبيثة. ومن خلال هذا الإجراء، ستكون سايما نسرين محمد، وهي فنيّة في مختبرنا.
للبدء، استخدم حلقات التلقيح العقيمة لزرع الثقافات النقية Yersinia روكيري على أي نوع من أنواع الـ agar المناسبة على أطباق بيتري. احتضان في 22 درجة مئوية لمدة يوم واحد إلى يومين أو 15 درجة مئوية لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. بعد ذلك، باستخدام حلقات التلقيح، واختيار مستعمرة تمثيلية واحدة من كل طبق بيتري ونقلها إلى أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر، التي تحتوي على 50 ميكرولترات من المياه النقية للغاية إلى resuspend.
دوامة لفترة وجيزة واحتضان لمدة سبع دقائق على كتلة التدفئة في 100 درجة مئوية. ثم، الطرد المركزي في 16،000 غرام لمدة ثلاث دقائق واستخدام ماصة لنقل بعناية الحمض النووي قالب فائقة إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي فارغة 1.5 ملليلتر. انتقل إلى الخطوة التالية أو تخزين الحمض النووي في 20 درجة مئوية.
لإعداد خلطات رئيسية، أولاً حساب كميات الكاشف وفقاً لعدد العينات البكتيرية التي سيتم تحليلها، مع احتساب عنصر تحكم سلبي واحد وتحكم إيجابي واحد، وحجم فائض نهائي بنسبة 10٪ كما هو مفصل في المخطوطة. لاحظ أن يتم استخدام تركيزات التمهيدي مختلفة. في اثنين من أنابيب الطرد المركزي منفصلة، واحدة لكل PCR المقايسة، إضافة MULTIX PCR بالإضافة إلى المزيج الرئيسي، التمهيدي، والمياه الخالية من RNase.
دوامة سيد مهيأ يمزج بلطف في سرعة منخفضة وثم، وتوزيع 22 ميكرولترات من كل مزيج رئيسي على حدة في الآبار الفردية على إما شرائط PCR أو لوحات. ثم، إضافة ثلاثة ميكرولترات من قالب الحمض النووي المعد إلى كل بئر يحتوي على مزيج رئيسي؛ بئرين لكل عينة بكتيريا، واحد لكل مقايسة. استخدام الحمض النووي من سلالة Yersinia روكيري التحقق من السيطرة الإيجابية، والمياه النقية جدا للسيطرة السلبية.
ختم وطاردة مركزية لفترة وجيزة. قم بتحميل التفاعلات المعدة على دورة حرارية PCR و إعداد البرنامج وفقًا للمخطوطة. سيتم إكمال البرنامج في أقل من ثلاث ساعات.
وفقا لتوصيات الشركة المصنعة، إضافة مسحوق هلام agarose في وقت واحد العازلة TBE للوصول إلى 1.5 الوزن / حجم في المئة والحرارة إلى حل. قبل الصب، هدئ محلول الجل المذاب لفترة وجيزة تحت الماء الجاري، إضافة 5 ميكرولترات من صبغة حمض النووي الفلورية لكل 50 ميكرولترات من محلول الجل ومزيج. تجميع ومستوى علبة الصب.
إضافة المخاريط حسب الاقتضاء لعدد من العينات. صب حل هلام في المدلى بها وانتظر حتى تتوطد. بعد ذلك ، غمر المدلى بها التي تحتوي على هلام في وقت واحد TBE العازلة في نظام جل الكهربائية.
مزيج خمسة microliters من منتجات PCR جنبا إلى جنب مع اثنين microliters من صبغة التحميل في شرائط PCR جديدة. نقل خمسة ميكروليتر من الخلائط إلى الآبار في الجل. حفظ واحد على الأقل فارغة جيدا.
إضافة خمسة microliters من سلم الحمض النووي في بئر فارغة للرجوع إليها. سد في الأقطاب الكهربائية وتشغيل الجل في 110 فولت لكل 15 سنتيمترا لمدة ساعة واحدة تقريبا. استخدم نظام تصوير هلامي قائم على الأشعة فوق البنفسجية للتحقق من وجود نطاقات متعددة تمثل ابلكونات PRC.
بعد تأكيد من AMPLICONs PCR، استخدم شرائط PCR جديدة أو لوحات لتخفيف منتجات PCR 1-10 في المياه النقية. دوامة وطرد مركزي لفترة وجيزة. أثناء العمل في خزانة الأبخرة، إعداد مزيج رئيسي في أنبوب الطرد المركزي تتكون من formamide والمحلول القياسي بالحجم المرجعي.
وفقا لعدد من منتجات PCR التي سيتم تحليلها، استخدم وحدات التخزين الكاشف كما هو مفصل في المخطوطة. السماح بفائض 10٪ حجم. دوامة لفترة وجيزة وتوزيع 9.5 ميكرولتررس في آبار فردية على لوحة PCR مناسبة لنظام الكهرباء الشعرية المتاحة.
ثم، إضافة 0.5 ميكرولترات من المنتج PCR المخفف. ختم وطاردة مركزية لفترة وجيزة. ثم، تحميل لوحة تحتوي على عينات في دورة حرارية PCR وتحريف العينات في 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق قبل التبريد إلى أربع درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
جهاز طرد مركزي في 1000 غرام لمدة دقيقة واحدة، وإزالة الختم بعناية، وتحميل لوحة على نظام الكهرباء الشعرية معايرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تشغيل تحليل الشرايلية الكهربائية، وذلك باستخدام الكواشف حسب الاقتضاء للجهاز الذي تختاره، وضبط ظروف تشغيل وفقا للوصف في المخطوطة. لYersinia ruckeri VNTR الشعيرات الدموية الكهربائية حجم الدعوة، أول استيراد الشعيرات الدموية ملفات نتيجة الكهرباء في جين مابر 5 البرمجيات.
تعيين طريقة التحليل إلى، الصغرى الصغرى، حدد اختيار المنتج المناسب تحت معيار الحجم، ثم اضغط على الزر تحليل. من خلال محرر مطابقة الحجم تحقق من التعريف الصحيح للأجزاء القياسية الحجم وتصحيح أي تخصيصات خاطئة بشكل واضح. ثم حدد النموذج الذي يجب قراءته، واضغط على زر رسم العرض، واضغط على عنصر التحكم A لتمكين عرض جدول تغيير الحجم.
أثناء وجوده في اللوحة العلوية ، اضغط باستمرار على التحكم ، أثناء النقر على القمم الخمس التي تمثل VNTR amplicons. اضغط على التحكم G لتصفية جدول تغيير الحجم، مع إظهار خصائص القمم الخمسة المميزة فقط، وسجل المكالمات حجم كل موضع VNTR لتطبيق المتلقين للمعلومات. من أجل حساب أنماط الحركة amplicon متحيزة أثناء الكهرباء الشعرية، وحساب دقيقة VNTR تكرار العد عن طريق استخدام المكالمات حجم المكتسبة في تركيبة مع المتغيرات محددة مكان.
قد يتم تطبيق الصيغة في قالب جدول بيانات للتنفيذ التلقائي. في جدول البيانات، يتم إجراء عمليات تكرار VNRT المحسوبة بشكل دائري إلى أقرب عدد صحيح قبل تحليل المصب. في البرنامج BioNumerics ، إنشاء قاعدة بيانات جديدة ، واختيار لتفعيل البرنامج المساعد MLVA.
في لوحة نوع التجربة، اضغط على إنشاء نوع تجربة جديد، واختر نوع الحرف، واستخدم الإعدادات الافتراضية عند طلب ذلك. ثم حدد التجربة الجديدة وإضافة أحرف جديدة لكل من loci 10 VNTR، وتوظيف صفر إلى 100 كمدى القيمة. مرة أخرى في اللوحة الرئيسية، استيراد Yersinia روكيري VNTR تكرار العد والبيانات الأسلوب عن طريق تحديد حقول الاستيراد والأحرف.
حدد موقع الملف حيث يتم تخزين هذا وإجراء التحديدات في العمود نوع الوجهة. بالنسبة لـ VNTRs، يعني هذا تحديد قيمة الأحرف المناسبة، بينما يتم تصنيف بيانات التعريف المتنوعة كـ حقول معلومات الإدخال. قد يتم تخزين الخيارات التي تم إجراؤها كقالب لتسهيل العملية في وقت لاحق.
حدد نماذج مستوردة موجهة لتحليل الكتلة MST، ثم انقر فوق الزر إنشاء مقارنة جديدة في لوحة المقارنات. إذا رغبت في العرض التقديمي المرئي MST، قم بتخصيص العينات إلى المجموعات الملونة، على سبيل المثال، وفقاً لميزة بيانات تعريف معينة. ثم حدد متقدمة الكتلة التحليل و MST للبيانات الفئوية لإنشاء رسم تخطيطي MST استناداً إلى نماذج المختارة.
مزيد من تعديل العرض التقديمي المرئي لـ MST عن طريق إضافة معلمات القسم، أطوال ال cross، تسمية فرع العقدة، إلخ. إذا لزم الأمر، قم بتصدير MST التي تم الانتهاء منها بتنسيق مطلوب باستخدام تحديد صورة التصدير. بعد تعدد PCR، تُتحقق صورة الجل الكهربائي من وجود احمولونات متعددة في جميع الممرات الـ 12 التي تحتوي على عينات، مع وجود الممر الأول الذي يمثل سلم الحمض النووي المستخدم.
في electropherograms الناتجة عن الكهرباء الشعرية، يمكن تحديد Loci VNTR مختلفة وفقا لمزيج من الحجم وصبغ التسميات. تمثل القمم البرتقالية الحجم القياسي المستخدم. مثال على شجرة تمتد الحد الأدنى، استنادا إلى ملامح MLVA من عزل Yersinia روكيري تعافى من سمك السلمون الأطلسي في خمس مزارع النرويجية المختلفة.
ويمكن ملاحظة نزعة تجمع واضحة مرتبطة بأصل المزرعة. وقد تم بالفعل استغلال تحديد MLVA لمختلف استنساخ Yersinia ruckeri التي تسيطر، على سبيل المثال، على المناطق الجغرافية لأنواع الأسماك، لتحسين استراتيجيات التطعيم ضد هذا الممرض.
