يسهل هذا البروتوكول عزل المجموعات الفرعية الليفية المتميزة وظيفيًا عن الجلد البشري عن طريق فرز FAC استنادًا إلى تعبير علامة سطح الخلية. لأول مرة، يمكن عزل الخلايا الليفية الحليمية والليفية الشبكية مباشرة عن الجلد دون التلاعب في المختبر. هذا هو تقدم كبير بالمقارنة مع أساليب العزل التي أنشئت سابقا باستخدام الثقافات explant.
مجموعات فرعية الورم الليفي الجلدي تأوي وظائف مميزة في ظل ظروف مصغرة. مع هذه الأداة ، من الممكن التحقيق في الاختلافات الوظيفية في أمراض الجلد ، بما في ذلك السرطان أو أمراض الجلد الالتهابية. وبما أن التعامل مع الأنسجة البشرية يتطلب بعض الممارسة لتحقيق غلة الخلايا مرضية، نود أن نقدم عرضا مرئيا لتسهيل وتسريع هذه العملية.
لتحضير الأدمة ذات السماكة الكاملة، ضع قطعة من جلد الإنسان على ورقة فلتر سميكة مع البشرة التي تواجهها إلى الأسفل. عقد البشرة بإحكام مع ملقط، وكشط قبالة طبقة الدهون تحت الجلد مع مشرط. ثم، شريحة الأنسجة إلى شرائح بعرض خمسة ملليمترات قبل وضعها في طبق بيتري.
لقسم الأدمة إلى طبقات حليمية وطبقات شبكة، ضع قطعة من الجلد على ورقة فلتر سميكة مع البشرة التي تواجه صعودا. أمسك البشرة بإحكام على حوافها مع ملقط، وشريحة من قسم من سمك 300 ميكرومتر مع جلدية كهربائية. نقل الطبقة الأولى التي تتكون من البشرة والأدمة الحليمة إلى طبق بيتري.
ثم، والمضي قدما على الفور لفصل البشرة والأدمة، أو إضافة 1X PBS للحفاظ على الأنسجة من الجفاف. بعد ذلك، ضبط الجلد إلى سمك قطع من 700 ميكرومتر، وشريحة الأدمة المتبقية. ضع الشريحة العليا، والتي تعرف كأدمة شبكة علوية، في طبق بيتري منفصل.
في وقت لاحق، كشط بعيدا طبقة الدهون تحت الجلد مع مشرط من طبقة الجلد التشنجي المتبقية، وتجاهل ذلك. جمع الأدمة شبكة السفلي في طبق بيتري آخر. المضي قدما على الفور لإجراء الهضم الأنزيمي، أو إضافة 1X PBS للحفاظ على الأنسجة من الجفاف.
لأداء الهضم الأنزيمي، ضع شرائح الجلد من خمسة ملليمترات أو الأدمة البشرة/الحليمة مع البشرة التي تواجه صعودا في طبق بيتري مع 10 ملليلتر من محلول الإنزيم المنفصل. ثم، احتضان طبق بيتري في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة، نقل الأدمة البشرة / الحليمات إلى غطاء طبق بيتري.
فصل البشرة من الأدمة العليا مع اثنين من ملقط، كل عقد حافة الأدمة. في وقت لاحق، المفروم كل طبقة الجلد بدقة قدر الإمكان. كلما كانت القطع أصغر، كلما كان هضم الأنسجة أفضل.
ثم، إعداد مزيج الهضم. نقل الأنسجة المفروم مع 10 ملليمترات من مزيج الهضم المعدة في أنبوب 50 ملليمتر. احتضان الأنسجة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة تحت الهياج.
عكس الأنبوب عدة مرات أثناء الهضم. لإعداد تعليق أحادي الخلية، أوقف هضم الأنسجة الأنزيمية عن طريق إضافة 10 ملليلترات من الوسط الليفي إلى الأنسجة المهضمة على الجليد. المقبل، صب محتويات كل أنبوب من خلال مصفاة الشاي غير القابل للصدأ العقيمة العادية، وجمع تعليق الخلية في طبق بيتري نظيفة.
غسل المصفاة مع المتوسطة، والهريس قطع الأنسجة غير مهضومة مع حافة المكبس حقنة. بعد ذلك، الماصات تعليق الخلية التي تم جمعها من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 ملليلتر. شطف مصفاة الخلية مع المتوسطة، وجمع تدفق من خلال نفس الأنبوب.
ثم، الطرد المركزي الأنبوب في 500 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة نافع، وغسل بيليه الخلية مع خمسة ملليلترات من المتوسطة الليفية. كرر خطوة الطرد المركزي مرة أخرى.
بعد ذلك، إزالة supernatant، وإعادة ربط بيليه في ملليلتر واحد من ACK lysis العازلة. ترك الخلايا في عازلة تحلل لمدة دقيقة واحدة تقريبا في درجة الحرارة المحيطة. ثم، وقف تحلل بإضافة تسعة ملليلتر من 1X PBS مع 10٪ FCS.
جهاز طرد مركزي الأنبوب مرة أخرى في 500 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، والتخلص من مُنَتَكَر في وقت لاحق. بعد أن تم تلطيخ الخلايا لفرز FAC التالية البروتوكولات القياسية، فرز ثلاثة subpopulations الخلايا الليفية في أنابيب منفصلة microcentrifuge شغلها إما مع 350 microliters من العازلة تحلل لعزلة RNA أو 350 ميكرولترات من الليفية المتوسطة النمو لثقافة الخلية. عكس الأنابيب على الفور، وإما وضع أنابيب العازلة تحلل في النيتروجين السائل، أو وضع أنابيب متوسطة النمو الليفي على الجليد.
بعد FACS، تدور الخلايا إلى أسفل في 500 مرات ز لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية. ثم، لوحة كمية متساوية من الخلايا في المتوسطة نمو الخلايا الليفية في طبق ثقافة الخلايا 24-جيدا، وتركها لتنمو حتى تصل إلى 70٪التقاء. بعد ذلك، استبدل الوسيطة خلية مثقف مع الوسيطة تمايز adipocyte، والسماح للخلايا التفريق لمدة 14 يوما.
في يوم التمايز 14، إصلاح الخلايا مع 4٪ PFA لمدة 20 دقيقة. غسل الآبار مع 60٪ isopropanol، والسماح لها تتبخر تماما. ثم، وصمة عار الخلايا مع خمسة ملليمولار من النفط الأحمر تصفية O لمدة 20 دقيقة.
بعد 20 دقيقة، قم بغسل الخلايا الملطخة أربع مرات بالماء المقطر. صور الخلايا المغمسة في الماء مع مجهر مقلوب في التكبير 10x مع الضوء المنقول. هذا البروتوكول يتيح تحديد ثلاث مجموعات الخلايا الليفية في الجلد البشري، والذي يقدم مع توطين intradermal مختلفة، ملامح التعبير الجيني، والوظائف.
يتم إثراء األجابية CD90-السلبية في الأدمة الحليمية، في حين أن األجابية CD90-إيجابية وFAP-السلبية CD90-إيجابية هي أكثر وفرة في الأدمة الخلوية. جميع الشعَب الفرعية الثلاث التي تم فرزها تعرض مورفولوجيا الخلايا الليفية النموذجية على الثقافة لمدة سبعة أيام. ومن المثير للاهتمام، أنها تتصرف بشكل مختلف في فحص اديبونجينيسيس.
بعد 14 يوما في الثقافة، FAP-إيجابية CD90-السلبية لا تفرق إلى adipocytes، في حين FAP إيجابية CD90-إيجابية وFAP-السلبية CD90-إيجابية بسهولة الخضوع لdipdipogenesis. يظهر تنميط التعبير الجيني أن الخلايا السلبية لـ CD90 -اإيجابية FAP تعبر عن مستويات عالية من العلامات التي تُنسب عادة إلى الخلايا الليفية الحليمية، مثل CD26 وNTN وPDPN، في حين تعبر الخلايا الإيجابية CD90 عن علامات النتزمات المعروفة، مثل CD36، وdinsly muscle smooth، وPPAR-gamma عند مستويات عالية. نستنتج أن الخلايا السلبية CD90-1999 هي الخلايا السلبية من الصفحوم والخلايا الإيجابية CD90 تنتمي إلى النسب النتّي.
الهضم يعمل بشكل أفضل إذا تم مفر قطع الجلد جيدا ومحتضنة في كمية كافية من وسط الهضم. المجموعات الفرعية الليفية الجلدية متنوعة وظيفيا. استكشاف وظيفتها في سياق مرض المرض من شأنه أن يمهد الطريق للتدخلات التشخيصية والعلاجية الجديدة.
