يسهل هذا البروتوكول استخدام الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات البشرية لتطبيقات الفحص عالية المحتوى. وهي مناسبة بشكل خاص لمسايسة نقاط الاشتباك العصبي، والتي تتطلب في الخلايا العصبية البشرية فترات ثقافية طويلة. نحن نبرهن على إعادة طلاء الخلايا العصبية من أطباق التنسيق الكبيرة إلى آبار متعددة متوافقة مع HCS بطريقة تحافظ على قدرتها على البقاء.
على نحو غير بديهي، نظهر أن توسيع حضانة البروتياز قبل إعادة الإنفاق وإعادة الطلاء يؤدي إلى تحسين البقاء على قيد الحياة العصبية. الخلايا العصبية البشرية متعددة القدرات المستمدة من الخلايا الجذعية هي ذات الصلة على نحو متزايد في مجالات البحوث الأساسية, تطوير المخدرات, والطب التنكسية. يمكن استخدام طريقة المعايرة اللطيفة هذه لإعادة تعليق أي طبقة أحادية كبيرة من الخلايا التي تحتوي على شبكة سميكة من العمليات.
بالإضافة إلى iPSCs الإنسان، يمكن استخدامه لإعادة زراعة الخلايا العصبية الأولية أو لإعادة تعليق لهم لفرز الحقائق أو تسلسل خلية واحدة. من المهم اتباع الخطوات البروتوكولات بعناية وكثيرا ما ترصد مفرزة protease بوساطة من الخلايا العصبية من لوحة. قد تختلف فترة الحضانة المثلى، اعتمادا على الثقافة.
مظاهرة بصرية تمكن حتى المحققين عديمي الخبرة لإعادة إنتاج هذا الإجراء. ابدأ بشطف طبق الخلايا العصبية المتمايزة مع برنامج تلفزيوني. تفريق برنامج تلفزيوني أسفل جدار لوحة وليس مباشرة على الخلايا لتجنب تعطيل لهم.
التعرق في برنامج تلفزيوني من حافة الطبق في حين البقشيش، مع الحرص على عدم لمس الخلايا. تطبيق ما لا يقل عن ملليلتر من انزيم البروتيوليتيك لكل لوحة 10 سم. وإرجاع الخلايا إلى الحاضنة لمدة 40 إلى 45 دقيقة.
أثناء الحضانة، والتحقق من الخلايا العصبية على مجهر التباين على مراحل ومواصلة علاج البروتياز حتى تنفصل الشبكة العصبية تماما من لوحة ويبدأ في كسر. عندما تكون الخلايا العصبية قد فصلت، ووقف الهضم عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام ديمي جديدة لكل ملليلتر واحد من protease. استخدام ماصة المصلية لتكهد الخلايا برفق ضد لوحة خمس إلى ثماني مرات، مع التأكد من عدم تطبيق الكثير من الضغط.
سلالة الخلايا من خلال شبكة 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر، قطرة قطرة. وشطف المصفاة مع خمسة ملليلتر إضافية من وسائل الإعلام DMEM الطازجة. استخدم جهاز طرد مركزي علوي لتدوير الخلايا بسرعة 1000 مرة G لمدة خمس دقائق.
بعد الطرد المركزي، والعودة أنبوب مخروطي إلى مجلس الوزراء السلامة الحيوية وpirate معظم وسائل الإعلام، وترك 250 ميكرولترات للحفاظ على الخلايا رطبة. بلطف resuspend الخلايا في مليلتر اثنين من وسائل الإعلام DMEM الطازجة ثم تمريرها من خلال نهاية ماصة المصلية ملليلتر خمسة. أخيرا، عكس الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات.
استخدام مقياس للهيمواي والزرقاء ثلاثية لحساب الخلايا القابلة للحياة. ومن ثم DMEM إلى التركيز المطلوب. إضافة المكملات الغذائية المناسبة للأنبوب، اعتمادا على متطلبات خط الخلية محددة وخلط بلطف الخلايا عن طريق إمالة أنبوب مخروطي مرتين إلى ثلاث مرات.
طلاء اللامينين السبيرات من لوحة 24-well وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. الطامح برنامج تلفزيوني. وتطبيق حل الخلية على كل بئر في حركة الرقم ثمانية لتجنب تكتل.
عند الانتهاء من طلاء الخلايا، والعودة لوحة إلى الحاضنة تعيين في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بإيجاز دوامة الأسهم حل من الخلية مبكّرة موت مراسلة وإضافته إلى الآبار وفقا ل المخطوطة توجيهات. انتظر 20 دقيقة
ثم صورة الخلايا الحية والميتة على الآبار الزجاجية متعددة القاع. إطالة حضانة protease يسمح تخفيف شبكة الخلايا العصبية داخل ورقة رفعت من الخلايا. وهذا يؤدي إلى انخفاض موت الخلايا في وقت الانفصام، فضلا عن النتائج في الانتعاش أكثر كفاءة خلال الأيام التالية.
باستخدام إجراء حضانة الإنزيم الممتد ، تظهر الثقافات مضاعفة تقريبية لقابلية الخلية خلال الأيام التي تلت إعادة الطلاء وكثافة أقل للخلايا الميتة أو المحتضرة. المرحلة الانتقالية من التمايز العصبي تجري على مدى عدة أيام، خلالها الخلايا التعبير تدريجيا علامات الخلايا العصبية في مرحلة متأخرة. يتم الكشف عن هذه العلامات على الفور في الثقافات التي تم إعادة اِسْتِرْحها بعد أربعة أسابيع من التمايز المسبق.
بروتوكول البروتياز الموسعة أيضا يعزز بشكل معتدل نوريميد الخروج. يتم تحسين كل من الطول الكلي النوريميد ونمو التشعب. إعادة الطلاء مفيد أيضا لدراسة نقاط الاشتباك العصبي.
بعد أسبوع واحد فقط من إعادة الطلاء ، لوحظت علامات للبروتينات قبل وبعد متشابك. وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن النشاط الكهربائي من إزالة القطب التلقائي والتيارات التي يحركها متشابك باستخدام تصوير الكالسيوم أو صفائف متعددة الأقطاب. يمكن تكييف هذا الإجراء إعادة طلاء إلى أنواع كثيرة من التطبيقات.
بالإضافة إلى فحص المحتوى العالي لتحديد المركبات العلاجية المحتملة ، يمكن استخدامه لتصوير المخاريط النمو أو تسجيلات صفيف multielectrode. تفكك الميكانيكية من الخلايا العصبية التي شكلت بالفعل عمليات طويلة هو المجهدة. إن الحضانة الأنزيمية الممدودة والتكهّل اللطيف للخلايا هي خطوات أساسية لنجاح هذا الإجراء.
