الهجرة الخلوية هي عملية شفاء الجروح الحرجة التي يمكن أن تغير جذريا نتيجة الجرح الشفاء. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بفهم أفضل لتأثير المركبات المختلفة على الهجرة الخلوية أثناء التئام الجروح. والتي يمكن أن تؤدي في كثير من الأحيان إلى استراتيجيات علاجية مستهدفة للطب السريري.
إن المقايسة الصفرية هي نهج فعال من حيث التكلفة وعالي الإنتاجية لتوليد بيانات ذات معنى لتضميد الجروح قبل إجراء اختبار vivo مكلف ومكثف للوقت. الحكّام كطريقة بشكل خاصّ مهمّة في جرح تضميد جراح تطبيقات. على وجه التحديد، الجلد.
ومع ذلك ، فإن الفحص هو في الحقيقة مقايسة هجرة ، ويمكن تطبيقه على أي نوع خلية حيث يكون ترحيل الخلايا مهمًا لقياسه أو التقاطه. مماثلة لثقافة الخلايا والأنسجة الكلاسيكية ، وإجراءات التشغيل القياسية ، والتدريب ، والتقنية ، والممارسة ، والممارسة. تلك هي مفتاح النجاح مع الحكة.
وسيكون من بين البرهان على الإجراء ناثان كروز، وهو طالب ماجستير، وأوسكار لوجان، وهو باحث جامعي. لبدء هذا الإجراء، وإعداد مجلس الوزراء السلامة البيولوجية II باستخدام 70٪ محلول مائي isopropyl لإجراء مسح الصرف الصحي، بدءا من الجدران الخلفية والجانبية، والعمل وصولا الى اللوح الأساسي. أيضا مسح أسفل جميع المواد التي سيتم استخدامها في المقايسة قبل وضعها في مجلس الوزراء.
بعد ذلك، الحصول على قنينات تحتوي على خط الخلية المبردة المطلوبة، ووضع واحدة في حمام مائي عميق سنتيمتر واحد في 37 درجة مئوية لذوبان الجليد. إضافة 10 ملليلتر من المتوسطة تكملها 10٪ FBS في قارورة زراعة الأنسجة T75. فتح القارورة التي تحتوي على مخزون الخلية، وpirate بعناية الحل.
ثم نقل الخلايا إلى قارورة T75. إزالة ملليلتر واحد من وسائل الإعلام من القارورة، ونقلها مرة أخرى إلى القارورة، ومن ثم نقله مرة أخرى إلى قارورة لتعظيم العائد الخلية من القارورة. تشديد قبعة القارورة وروك بلطف عليه لتفريق موحدة الخلايا في تعليق عبر السطح بأكمله.
بعد هذا، ضع القارورة بالمعلومات المعروضة هنا، ووضعها في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. أولاً، استرداد قارورة زراعة الأنسجة من الحاضنة، ومراقبة الخلايا الملتزمة كما هو موضح في بروتوكول النص. التعرق كامل حجم وسائل الإعلام من قارورة ونقلها إلى حاوية النفايات.
إضافة خمسة ملليلتر من محلول الملح متوازن إلى القارورة، والصخور بلطف لشطف أي وسائل الإعلام الزائدة، والخلايا الميتة، أو النفايات المنتج. ثم إزالة كامل حجم محلول الملح من القارورة والتخلص منه في حاوية النفايات. بعد ذلك ، أضف مليلترين من التربسين إلى القارورة ، وخرزها بلطف لتفريق الإنزيم فوق الخلايا الملتزم بها.
تأكد من أن سطح الملتصا مشبع تماما، ووضع قارورة الأنسجة في الحاضنة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد ذلك، اضغط بلطف على جانب القارورة ثلاث إلى خمس مرات للمساعدة في تسهيل انفصال الخلية. امسح القارورة بـ 70٪ من الكحول، ووضعها في خزانة السلامة البيولوجية.
إضافة خمسة ملليلترات من وسائل الإعلام الأسهم إلى قارورة الأنسجة لوقف رد فعل الركيزة الانزيم. استلهم حجم السائل بالكامل من القارورة، ونقله إلى أنبوب مخروطي مُعقم 15 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي في 200 مرة ز و 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
ثم استخدام 70٪ الكحول لمسح أسفل الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا بيليه، ووضعها داخل مجلس الوزراء السلامة الحيوية. ماصة قبالة وسائل الإعلام، وترك وراء ما يقرب من 250 ميكرولترات من السوائل مع بيليه الخلية. تشغيل الجزء السفلي من أنبوب مخروطي عبر فتحات القارورة من رف أنبوب microcentrifuge لخلق اهتزاز سريع والانزعاج وإعادة تركيب بيليه الخلية.
عندما تكتمل بشكل صحيح، سوف تظهر حل الخلية الجديدة كخليط غائم مع أي بيليه المتبقية. إضافة ملليلترين من الوسائط إلى إعادة الإضافة الخلية. ماصة الخلايا بلطف صعودا وهبوطا على جانب الأنبوب 20 مرة لتفريق أي كتل.
وسجل حجم إجمالي تعليق الخلية. بعد ذلك، استخدم ماصة معقمة لإضافة 20 ميكرولترات من الأسهم الزرقاء trypan إلى بئر فارغة من لوحة 96 جيدا. باستخدام تلميح ماصات معقمة، نقل 20 ميكرولترات من مخزون الخلية من أنبوب 15 ملليلتر إلى البئر التي تحتوي على حل تريبان الأزرق.
الماصات بلطف لخلط المحتويات ونقل 10 ميكرولترات من الخليط بين زلة الغطاء وغرفة العد على مقياس الدم. عد الخلايا فقط في الوسط وأربعة مربعات زاوية، بشكل منفصل حساب كل من العدد الكلي للخلية وعدد الخلايا غير قابلة للحياة للمربعات الخمسة التي تم تحديدها. بعد حساب عدد الخلايا القابلة للتطبيق، ضع علامة على خط أفقي عبر الجزء السفلي من لوحة 12-well لتكون بمثابة علامة مرجعية أثناء التصوير.
تخفيف مخزون الخلية مع وسائل الإعلام إلى كثافة 19،000 خلية لكل ملليلتر. ثم بذور كل بئر من لوحة 12-جيدا مع ملليلتر واحد من مخزون الخلايا المخففة، وخلط مخزون الخلية بشكل دوري لضمان حتى بذر الخلايا عبر جميع الآبار 12. تسمية كل لوحة مع المعلومات المعروضة هنا.
ووضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تنمو الخلايا إلى التقاء 100٪. استرداد لوحة 12-جيدا مع الخلايا من الحاضنة. باستخدام المجهر مع هدف 10x، ومراقبة الخلايا وتحديد التقاء داخل كل بئر.
المقبل، والطامح والتخلص من وسائل الإعلام النمو من كل بئر. تجميع أنبوب P200 مع 1-200 تلميح معقم ميكرولتر. في كل بئر، تنزلق طرف ماصة عبر سطح الخلية من موقع 12:00 إلى موقع 6:00 لإنتاج جرح وهمية خدش.
شطف كل بئر مع ملليلتر واحد من محلول الملح متوازن لمسح بعيدا الحطام الزائد وكتل الخلايا. صخرة لوحة من جانب إلى آخر لتسهيل الغسيل. ثم إزالة والتخلص من محلول الملح متوازن من كل بئر.
باستخدام أنبوب P1000 مع طرف 1، 000 ميكرولتر، إضافة 1،000 ميكرولتر من مخزون الزرنيخ المعدة في الآبار التي تم تعيينها عشوائيا مع مجموعة العلاج. استخدمي نصيحة جديدة للميصة لكل بئر، وسجلي الوقت الذي تتم فيه إضافة العلاجات. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
لتصوير اللوحات، التقط صور كل بئر في التكبير الموضوعي 10x كل أربع ساعات على مدى 24 ساعة. الرجوع إلى الخط الذي تم رسمه مسبقًا على الجزء السفلي من اللوحة إلى صورة نفس الموقع على طول الخدش داخل كل بئر في كل نقطة زمنية. في هذه الدراسة، يتم استخدام اختبار خدش الجسم الحي لمراقبة آثار الزرنيخ على هجرة الخلايا.
ويلاحظ الخدوش موحدة في جميع مجموعات العلاج، مع متوسط عرض الصفر من حوالي 0.8 ملليمتر. تظهر خلايا التحكم خدشًا مُشفى تمامًا بعد 20 ساعة. لا تظهر المجموعتين الزرنيخ هذا المستوى من الشفاء.
مع علاج 10 ميكرومولار تثبيط الإغلاق تماما لمدة 24 ساعة. وتبين هذه النتائج أن وجود الزرنيخ يبطئ الهجرة الخلوية. يتم تحليل الصور الخام التي تم التقاطها أثناء الفحص باستخدام برنامج آلي لقياس عرض الجرح ، ثم حساب نسبة الإغلاق ، وأخيراً حساب المنطقة تحت المنحنى.
تُظهر مجموعة علاج الـ10 ميكرومولار الهجرة الخلوية البطيئة إحصائيًا للتليف الجلدي البشري الوليدي مقارنة بجميع مجموعات العلاج الأخرى. من المهم أن تمارس بدقة هذه التقنية لزيادة الاتساق عند خدش الخلايا. يمكن أن يؤدي التغير غير المقصود بين المقايسات إلى انحراف البيانات وتغيير الاستنتاجات.
ويمكن استخدام تقنيات جزيئية أخرى مثل تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل ومقايس المناعة المرتبطة بالانزيم بعد الخدش لتحديد إشارات الرسول والبروتينات التي قد تكون هدفًا للتغييرات في هجرة الخلايا التي لوحظت في الفحص. وقد ساهم هذا الفحص في فهم الباحثين لتشائل السرطان، وعلاجات السرطان الناشئة الجديدة، والخلايا الجذعية والطب التجديدي، والعديد من المعالم العلمية الأخرى.
