كيفية تحديد جزء صغير البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتيد بكميات كبيرة وفي الخلايا الحية

نقدم هنا بروتوكول يتضمن الاقتران جينياً بشكل طيفي متميز للصور القابلة للتفعين والبروتينات الفلورية. تسمح هذه المساطر الداخلية بالكمية من جزء PAFP الذي يتم تنشيط الصورة لتكون الفلورسنت. حتى الآن، لم تكن هناك طريقة متاحة لتحديد كمي في الجزء الأكبر في خلايا الحياة كم من PAFP أعرب عن الصورة تنشيطها إلى الفلور. وتجسد الكمية المعروضة لكفاءة تنشيط الصور PA-GFP و PA Cherry في الخلايا الحية ولكنها من حيث المبدأ قابلة للتطبيق على نطاق واسع ويمكن استخدامها لأي بروتين فلوري قابل للتنشيط في ظل أي حالة تجريبية. كلما كان العمل مع البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا، فإن المبلغ المطلق من البروتينات التي أعرب عنها يختلف من خلية إلى خلية وأنه غير معروف. لتوحيد التعبير بين الخلايا، نقدم حكام داخليين من البروتينات الفلورية المتميزة من الناحية الجينية. عن طريق اقتران المعلومات الوراثية من البروتين الفلورسنت القابلة للتفعيل بالصور إلى متميزة طيفيا دائما على المساطر الداخلية البروتين الفلورية التي سيتم إنشاؤها لا يزال يتم التعبير عن كمية إجمالية غير معروفة ولكن في كمية نسبية ثابتة معروفة من واحد إلى واحد. لبدء بناء البلازميدات كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. أيضا، والثقافة في خط الخلية القياسية في وجهة نظرها المتوسطة باستخدام النسخة الحمراء الفينول. عندما تكون على استعداد لبدء التجربة، حصاد الخلايا باستخدام التربسين دون أحمر الفينول للحد من الفلوركنس الخلفية. بعد الحصاد، تعبئة ماصة 2 مل مع تعليق الخلية من ثقافة الخلية التقاء نمت في قارورة ثقافة خلية T 12.5. إضافة قطرة واحدة في كل غرفة من ثمانية قطعة زجاج الغرفة الشريحة. احتضان الشريحة تحت شروط ثقافة الخلية القياسية لمدة 24 ساعة. نقل الخلايا التالية باستخدام الكواشف التجارية التالية بروتوكول الموزعين. Transfect الخلايا مع GFP الكرز، PA-GFP الكرز وGFPPA الكرز الكيميرا. ثم إعادة الخلايا إلى الحاضنة للسماح للتعبير البروتين، للطي، والنضج. بعد ما مجموعه 20 ساعة بعد النقل، ونقل الخلايا إلى مرحلة مجهر فلورسنت confocal مجهزة غرفة بيئية مرطبة وساخنة قبل warmed إلى 37