يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات أبحاث علم الأعصاب والطب الحديث التقليدي حول فحص المركبات الطبيعية العصبية ذات الصلة بالنموذج. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن ارتفاع قابلية إنتاج حجم العدوى هو وفقا لجرعة توقيت الإقفار. مظاهرة بصرية من هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية كما هو نموذجي لإدراج تنفيذ رقيقة جدا في الأصلي، الشريان cerebellar الأوسط باستخدام المجهر العقيم.
إثبات الإجراء سيكون سي أون لي، وهو طالب في مدرسة يدرس في مختبري. لإعداد استخراج جليسيريزاي راديكس ورهيزومي، أو GRex، أولاً إضافة 200 غرام من Glycyrrhizae راديكس et Rhizome، أو GR، إلى لترين من الميثانول لمدة خمسة أيام حضانة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، سلالة الحل من خلال ورقة مرشح سميكة 0.26 ملليمتر مع حجم المسام 5 ميكرومتر.
إضافة بقايا GR إلى لتر واحد من الميثانول الطازجة، وتصفية الحل مرة أخرى. الجمع بين filtrates اثنين، وتجهد لهم من خلال قطعة جديدة من ورقة مرشح. ثم ركز استخراج تحت فراغ قبل تجميد التجفيف لإنتاج GRex.
لإعداد GRex للإدارة، قم بحل المنتج المجفف بالتجميد في ثنائيthylsulfoxide، وتمييع الخليط مع محلول ملحي فسيولوجي بنسبة 0.9٪. ثم تصفية الحل من خلال مرشح حقنة ميكرومتر 0.45، وضبط التركيز النهائي من DMSO إلى أقل من 5٪ لإعداد نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط الماوس، أو MCAO، تأكيد عدم الاستجابة لحافز الذيل في تخدير ستة أسابيع من العمر 22 إلى 25 غراما الذكور C57BL/6 الماوس، ووضع الماوس على 36.5 درجة مئوية درجة حرارة الجسم عقد بطانية، متصلة بميزان الحرارة. بعد إزالة جميع الشعر من الصدر والرقبة من الماوس عن طريق الحلاقة وكريم إزالة الشعر، ووضع الماوس تحت stereomicroscope وجعل شق الجلد سمين في وسط الرقبة.
عزل الشريان السباتي المشترك الأيسر، الشريان السباتي الخارجي، وفرع الشريان السباتي الداخلي من الأنسجة الضامة المحيطة، واستخدم خياطة 4.0 حريري لتحشي الشريان السباتي الخارجي والشريان السباتي المشترك مع عقدة نصف عقبة لمنع تدفق الدم مؤقتًا إلى الشريان السباتي الداخلي. إدراج خياطة 0.1 إلى 0.12 ملليمتر سميكة 11 ملليمتر طويلة سيليكون المغلفة 8.0-monofilament 4.0 الحرير من خلال الشريان السباتي الداخلي إلى أصل الشريان الدماغي الأوسط الأيسر، واستخدام الليزر دوبلر تدفق متر لقياس الانخفاض في الشريان الداخلي تدفق الدم الدماغي. إصلاح خيوط إدراجها في الأوعية الدموية لمدة ساعتين في حين يتم انسداد الشريان الدماغي.
في نهاية فترة الانسداد ، اسحب خيوط استعادة الدم بعناية لمدة 22 ساعة من إعادة الضخ. واستخدم 3.0 خياطة من الحرير لخياطة الجلد في خمسة أماكن مع عقدتين نصفي الهزاق. ثم العودة إلى قفص الماوس لاسترداد التخدير.
ساعة واحدة بعد نهاية reperfusion، وإدارة 300 ملليغرام لكل كيلوغرام وزن الجسم GRex للحيوانات التجريبية، فقط عن طريق ال gavage عن طريق الفم. بعد 24 ساعة من ظهور MCAO ، قم بعمل شق في الجلد الأوسط لرأس كل تجريبي ، وكسر العظام الجدارية مع ملقط الزاوية ، مع تقشير ماتر الجاف. عزل الدماغ بعناية عن الجمجمة، واستخدم مصفوفة دماغ الماوس لقطع الأنسجة المختّفة إلى أقسام سميكة من ملليمتر واحد.
وصمة عار المقاطع لمدة 17 دقيقة في 2٪ TTC الحل، وفقا للبروتوكولات القياسية. وإصلاح المقاطع في 10٪ formalin لمدة 2 ساعة على الأقل قبل تصوير العينات مع كاميرا رقمية. ثم تحليل وقياس المنطقة الدماغية في كل قسم باستخدام ImageJ.
في الوقت التجريبي المناسب بعد MCAO ، perfuse كل تجريبي القتل الرحيم transcardially مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ، تليها 10 ملليلتر من 4 ٪ paraformaldehyde. بعد عزل العقول كما أظهرت للتو، غمر الأعضاء المحصودة في 10 ملليلتر من 30٪ السكروز بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، تضمين عينات أنسجة الدماغ في مجمع درجة الحرارة القطع الأمثل.
وشريحة الأنسجة coronally إلى 15 ميكرومتر سميكة أقسام على سيروستات. جبل المقاطع على الشرائح الزجاجية وغمر المقاطع في 80٪ الإيثانول لمدة 1 دقيقة. لH & E تلطيخ، تسمية العينات مع حل الهماتيوكسيلين لمدة 5 دقائق، تليها اثنين من الانخفاضات في 1٪ من الكحول الحمضية.
بعد ذلك، غمر الشرائح في محلول كربونات الليثيوم المشبع لمدة 30 ثانية، متبوعًا بغسل 30 ثانية في ماء الصنبور، و30 ثانية من التلطيخ المضاد بمحلول إيوسين. إزالة حل Eosin الزائدة مع غسل المياه الصنبور، وتجفيف الشرائح مع الانغماس التصاعدي دقيقة واحدة في 95 ثم 100٪ الإيثانول. ثم، airdry الشرائح، واضحة لهم في إكسيلين لمدة 10 دقائق على الأقل، وجبل الأغطية مع المتوسطة المتصاعدة.
بالنسبة لتلطيخ البنفسج الكريلي، ضع الشرائح المعالجة بالإيثانول بنسبة 80٪ على شريحة أكثر دفئًا لمدة ساعة واحدة على الأقل، يليها الغمر في 50٪ من الإيثانول المخفف بالكلوروفورم بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، وصمة عار الشرائح مع 0.1٪ كريميل البنفسجي لمدة 10 دقائق في فرن جاف 40 درجة مئوية، تليها الجفاف في 95٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة، واثنين من خمس دقائق 100٪ الإيثانول الغمر. بعد ذلك، قم بمسح الشرائح اثنين من الغمرات الزيلين لمدة خمس دقائق، تليها تجفيف الهواء.
ثم تحميل الشرائح مع تصاعد المتوسطة للتصور عن طريق المجهر الخفيفة. في المجموعات العادية التي تعمل بالشامية ، لا يلاحظ أي فاركت دماغية ؛ في حين أن الحيوانات MCAO غير المعالجة ، يتم ملاحظة مجموعة واسعة نسبيًا من المناطق المتضررة. في 300 ملليغرام لكل كيلوغرام GRex فئران نموذج المعالجة، لوحظ انخفاض كبير إحصائيا في الأنسجة التالفة.
التحليل النسيجي لـ H&E و جليسيل النسيج البنفسجي الملون يوفر فهرساً لبقاء الخلية. في الواقع، H & E وكريسيل البنفسجي تلطيخ الشدة انخفاض كبير في السيطرة، غير المعالجة مجموعة MCAO نسبة إلى مجموعة طبيعية تعمل بشكل صوري. الحيوانات المعالجة GRex، من ناحية أخرى، تظهر قدرا أكبر من التكامل النسيجي، مما يعني أقل موت الخلايا العصبية من كل من مجموعات السيطرة، غير المعالجة والضيمة التي تديرها، مما يشير إلى تأثير العصبية قوية من استخراج ضد إصابة الدماغ الناجمة عن نقص التروية.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن تراقب تدفق الدم الداخلي في الدماغ خلال هذه الفترة. والموصلات من العمليات بعناية فائقة لتقليل الأضرار التي لحقت طبقات endothelial
