يمكن أن تساعد هذه الطريقة في معالجة الأسئلة المتعلقة بكفاءة، والعائد الانتعاش، ونقاء السائل lava قصبي طاردة مشتقة من خارج الخلية باستخدام نهج الطرد المركزي فائقة الترشيح. قارنا هذه التقنية مباشرة بتقنية الطرد الشديد الكثافة والتنقية الانحدارية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه بسيط وفعال ومناسب لعينات صغيرة الحجم مثل السائل lava القصبات الهوائية.
والأهم من ذلك أنه يوفر نقاء عالية وقابلية توسع أعلى بكثير مقارنة بطريقة العزلة فائقة التركيز. إثبات الإجراء سيكون السيد نورمان غاريت الثالث، باحث مشارك في مختبري. للبدء ، أدخل 22 مقياسًا لـ angiocatheter في القصبة الهوائية للماوس القتل الرحيم.
إرفاق حقنة الأنسولين مع ملليلتر واحد من الجليد الباردة DPBS العقيمة، وغرس ملليلتر واحد في كل من الرئتين. سحب ببطء المكبس حقنة لاسترداد السائل القصبي lava، أو السوائل BAL. و يوزع سائل BAL في أنبوب مخروطي على الجليد
بعد ذلك، سحب سائل BAL من 25 الفئران وتقسيمه إلى مجموعتين متساويتين. أجهزة الطرد المركزي السائل بال في 400 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. جمع طاردة فائقة والطرد المركزي في 15،000 مرات G في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
ثم جمع افرا والشروع في خطوات عزل EV على الفور. أولا، تصفية نات السوبر من خلال 0.2 ميكرومتر معقم فلتر الحقن. بعد ذلك، اكويترولتر وحدة تصفية الطرد المركزي مع DPBS العقيمة لمدة 10 دقائق.
ثم الطرد المركزي وحدة الطرد المركزي في 15، 000 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. املأ الفلتر بـ 15 ملليلتر من سائل BAL. و جهاز طرد مركزي في 3,000 G لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية.
بعد هذا، وغسل retentate مع 14 ملليلتر من DPBS العقيمة عن طريق الأنابيب بلطف مرارا وتكرارا. أجهزة الطرد المركزي وحدة التصفية في 3، 000 G في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة DPBS وتركيز retentate. لجمع السائل بال المركزة المستمدة EV، إدراج أنبوب في الجزء السفلي من وحدة التصفية، وسحب العينة باستخدام حركة شاملة من جانب إلى آخر.
ثم aliquot السائل BAL المستمدة EV وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. بدلا من ذلك، تبدأ عن طريق نقل السابق المكتسبة supernatant إلى أنبوب فائقة الوضوح. و جهاز طرد مركزي عند 10,000 جي لمدة 30 دقيقة بأربع درجات مئوية
ثم جمع المابير والطرد المركزي. تجاهل عظمى وإعادة تعليق بيليه EV في 200 ميكرولترات من DPBS. بعد ذلك، مزيج تعليق EV مع 300 ميكرولترات من 50٪ iodixanol حل العمل.
ونقله إلى أنبوب 15 ملليلتر فائقة الوضوح. ثم إضافة حل العازلة وفقا لبروتوكول النص لإنشاء التدرج كثافة الطفو، والطرد المركزي في 100، 000 G لمدة ثلاث ساعات و 50 دقيقة. جمع 15٪ و 25٪ iodixanol الكسور، وتمييع لهم في DPBS لجعل حجم يصل إلى 15 ملليلتر.
نقل الكسور إلى أنبوب جديد فائق التركيز الطرد والطرد المركزي في 100، 000 G في أربع درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. تجاهل افراط وإعادة تعليق الكريات EV في 50 ميكرولترات من DPBS العقيمة. لبدء تحليل تتبع الجسيمات النانوية، قم بتخفيف عينة EV في ملليلتر واحد من DPBS.
و حمّل العينة في حقنة الأنسولين بعد ذلك، قم بتوصيل الحقنة بمضخة حقنة، وقياس أرقام الجسيمات وحجمها. تعيين مستوى الكاميرا إلى 14 وعتبة الكشف عن واحد.
بعد ذلك، استخدم قارئ لوحة لتحديد كمية البروتين في عينة EV عن طريق الكشف colorimetric. قم بتلايب كمية مساوية من بروتين EV من كل عينة مع مخزن تحميل ينفر و DTT. ثم سخني العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
قم بتحميل العينات في جل الاكريلاميد Bis-Tris Plus واجري الكهرباء لمدة 35 دقيقة. ثم نقل البروتينات إلى غشاء نيتروسيلولوز باستخدام طريقة نقل الجافة. بعد ذلك، كتلة الغشاء مع خمسة في المئة الحليب منزوع الدسم لمدة 60 دقيقة مع هزاز لطيف.
احتضان الغشاء مع جسم مضاد لعلامة بروتين سطح EV في أربع درجات مئوية مع هزاز لطيف بين عشية وضحاها. تطوير الغشاء عن طريق احتضان الغشاء مع هدب هدب الأجسام المضادة ل 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الغشاء لمدة 10 دقائق مع العازلة TBST ثلاث مرات.
وأخيرا، تطوير الغشاء مع كاشف الكشف عن الأجسام المضادة للجسم CHEMILUMINEScent HRP قبل الشروع في التصوير. لبدء تدفق cytometry، تخفيف السوائل BAL المستمدة EV في 49 ميكرولترات من PEB تلطيخ العازلة. ثم إضافة ثلاثة أجسام مضادة لكل من العينات، قبل احتضان العينات في أربع درجات مئوية مع هزاز لمدة 60 دقيقة في الظلام.
وأخيرا، تمييع العينات مع 40 ميكرولترات من غشاء تصفية PEB تلطيخ العازلة وتنفيذ تحليل تدفق الخلايا. في هذا البروتوكول، تم عزل EV من سائل الماوس BAL باستخدام أساليب UFC و UC-DGC. بالسوائل BAL المستمدة EV من الفئران العادية المعزولة بواسطة طريقة UFC عرض أحجام أصغر وأكثر توزيع حجم موحدة من UC-DGC-EV.
وكان لتقنية UFC أيضاً عدد الجسيمات الإجمالي الأعلى بكثير بالمقارنة مع تقنية UC-DGC. وكان إجمالي استرداد البروتين الذي تم قياسه بالملليغرام من UFC-EV أعلى أيضًا من انتعاش UC-DGC-EV ، مما يشير إلى أن تقنية UFC هي أكثر كفاءة من الوقت والجهد. وأخيرا، تم أيضا وصف السائل BAL المستمدة EV 's كذلك عن طريق تدفق القياسات.
وأعرب كل من UFC - EV وUC - DGC EV في CD63 ، CD9 ، و CD81. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر إعادة تهطيب غشاء وحدة الترشيح الفائق مع DPBS. بمجرد رطوبة الغشاء ، يجب أن تظل الوحدة رطبة في كل وقت حتى يتم استخدامها.
يمكن أن يكون استرداد خلايا خارج الخلية من وحدة التصفية تحديًا. تأكد من أن يتم اجتاحت تلميح ماصة جنبا إلى جنب لاسترداد معظم EV من وحدة التصفية. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال عزل الخلايا خارج الخلية لاستكشاف الوظائف البيولوجية لمراحيض القصبات الهوائية المشتقة من الفُيَسَة خارج الخلية في كل من الظروف الطبيعية أو المرضية في الحيوانات الصغيرة.
