أدخل هذا البروتوكول طريقة محددة لخلية التغذية الحرة للتمييز بين الخلايا الجذعية الظهارية القرنية الطرفية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. الخلايا الجذعية الظهارية الطرفية هي المسؤولة عن تجديد الظهارية القرنية في العين السليمة. تلف هذه الخلايا يؤدي إلى حالة تعرف باسم نقص الخلايا الجذعية الطرفية، وإلى فقدان وضوح القرنية.
تمكن طرق زراعة الخلايا الموضحة هنا من إنتاج فعال للخلايا الجذعية الظهارية الطرفية لعلاجات استبدال خلايا القرنية المستقبلية. للبدء، مرور والحفاظ على تغذية وحدة تغذية خالية من ثقافة الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية كما هو مبين في بروتوكول النص. تأكد من استخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ذات الجودة العالية فقط كمواد البداية للتمايزات.
عندما تكون على استعداد للحث على تكوين الجسم الجنينية، الدافئة جميع المواد اللازمة والكواشف إلى درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك تدفق لارينار. فصل الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات المجانية إلى التعليق عن طريق إضافة 500 ميكرولترات من xeno free trypsin EDTA إلى كل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد ثلاث دقائق، قم بإزالة الخلايا من الحاضنة وتحقق من مورفولوجيا الخلية لتحديد المرحلة المثلى لإزالة التربسين. مراقبة الخلايا بعناية لتحديد الوقت الأمثل لإزالة tryspin EDTA الحرة xeno، عندما تم تجميع الخلايا، ولكن لم يتم فصل تماما. في الوقت الأمثل، إزالة تبسين الحرة EDTA xeno من الخلايا.
إضافة مثبطات التربسين المعرفة وماصات بلطف لفصل الخلايا. جمع تعليق خلية واحدة في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي في 300g لمدة خمس دقائق.
ثم، إزالة نابيرانت، وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسطة الثقافة. بعد عد الخلايا، وتوزيع اثنين إلى ثلاثة ملايين خلية في ثلاثة ملليلتر من المتوسط التعريفي القاعدية تستكمل مع خمسة blebbistatin ميكرومولار إلى كل بئر من مرفق منخفض ستة لوحة جيدا. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم التالي، تحقق من جودة الأجسام الجنينية تحت المجهر. إزالة المتوسطة، واستبدالها مع ثلاثة ملليلتر من المتوسط التعريفي القاعدية تستكمل مع 10 micromolar SB-505124 و 50 نانوغرام لكل ملليلتر من عامل نمو الألياف الزجاجية الأساسية البشرية. مواصلة احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليومين التاليين، وإزالة المتوسطة، واستبدالها مع ثلاثة ملليلتر من المتوسط التعريفي القاعدية، تستكمل مع 25 نانوغرام لكل ملليلتر من البروتين مورفوجينيك العظام أربعة. ثم، مواصلة الحضانة باستخدام الشروط السابقة. في اليوم الرابع، أعد خليطًا من 0.5 ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع من اللامينين-521، وخمس ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع من الكولاجين المشيمي البشري من النوع الرابع، المخفف في DPBS الذي يحتوي على الكالسيوم اثنين والمغنيسيوم أيونين.
باستخدام هذا الخليط، معطف 100 ملليمتر أطباق ثقافة الأنسجة لأتباع التمايز في حجم الطلاء الكلي من خمسة ملليلتر لكل طبق. ختم لوحات، وتخزينها في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم الخامس، تدفئ جميع المواد اللازمة والكواشف إلى درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك تدفق لامينر.
بعد ذلك، إزالة حل الطلاء وإضافة 10 ملليلتر من التمايز قبل الدافئة المتوسطة لكل طبق. باستخدام ماصة، نقل الهيئات الجنينية من لوحة واحدة جيدا عبر اثنين إلى ثلاثة أطباق ثقافة الأنسجة. ثم، يهز بلطف كل طبق الثقافة لتوزيع بالتساوي الهيئات الجنينية.
الحفاظ على الخلايا في ثقافة التمسك في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أسبوعين ونصف إلى ثلاثة أسابيع المقبلة، مع التأكد من استبدال المتوسطة مع 10 ملليلتر من التمايز الطازج المتوسط ثلاث مرات في الأسبوع. استخدام المجهر النقيض مرحلة للتحقق بانتظام الخلايا لظهور مورفولوجيا الظهارية الصحيحة. للبدء، قبل الدافئة جميع المواد اللازمة والكواشف إلى درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك تدفق المفارق، باستثناء وسط الحفظ التبريد، والتي ينبغي أن تكون مبردة مسبقا.
بعد ذلك، قم بفصل الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية الظهارية الطرفية إلى تعليق الخلايا المفردة عن طريق إضافة التبسين الحر xeno EDTA والاحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد خمس دقائق، قم بإزالة الخلايا من الحاضنة وتحقق من مورفولوجيا الخلية لتحديد المرحلة المثلى لإزالة التربسين. مراقبة الخلايا بعناية لتحديد الوقت الأمثل لإزالة EDTA تريبسين xeno الحرة، عندما تم تجميع الخلايا، ولكن لم يتم فصل تماما.
في الوقت الأمثل، قم بإزالة EDTA EDTA xeno الحرة، ثم قم بفصل الخلايا كما هو موضح سابقاً. بعد عد الخلايا، الطرد المركزي لهم في 300g لمدة خمس دقائق. التعرق المتوسطة، وإعادة تعليق الخلايا في ما قبل مبردة xeno الحرة التبريد المتوسطة.
باستخدام ماصة، نقل تعليق خلية واحدة في أنابيب التبريد بحيث يحتوي كل أنبوب التبريد بين 500،000 إلى مليون خلية في ملليلتر واحد من وسط الحفظ التبريد. ضع الأنابيب في وعاء متجمد. في غضون خمس دقائق، ونقلها إلى ثلاجة في درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية للتخزين ليلا.
في اليوم التالي، نقل الأنابيب إلى النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل. قبل ذوبان الخلايا، معطف جميع الأطباق اللازمة وآبار الصفائح مع خليط من خمسة ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع الكولاجين المشيمة الإنسان من النوع الرابع، و0.5 ميكروغرام لكل سنتيمتر مربع من LM-521، وقبل الدافئة جميع المواد اللازمة والكواشف إلى درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك الرأس تدفق الفات. بعد ذلك، إزالة حل طلاء من الأطباق وآبار لوحة وإضافة حجم مناسب من التمايز قبل الدافئة المتوسطة.
إضافة ما قبل الدافئة التمايز المتوسطة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. ذوبان الخلايا بسرعة إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد إذابة، نقل على الفور تعليق الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي.
جهاز طرد مركزي في 300g لمدة خمس دقائق. التعرق المتوسطة، وإعادة تعليق بيليه الخلية في التمايز المتوسطة لإزالة أي وسيط التبريد. لوحة الخلايا على أطباق مُنَطَّتة في وسط التمايز بكثافة 40، 000 إلى 50،000 خلية لكل سنتيمتر مربع.
الحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون، والاستعاضة عن متوسط التمايز ثلاث مرات في الأسبوع. في Laminin-521، فإن الخلايا الجذعية البشرية غير المتمايزة ذات الجودة العالية الخالية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات تشكل أولاً مستعمرات متميزة ذات حواف حادة، تندمج في طبقات أحادية متجانسة عند الالتقاء. زراعة في المتوسطة التعريفي القاعدية، وتستكمل مع خمسة blebbistatin micromolar لمدة 24 ساعة تنتج عادة تعليق من ضيق، الهيئات الجنينية العادية من مختلف الأحجام، في حين أن مورفولوجيا الجسم الجنينية لا ينبغي أن تتغير بشكل كبير خلال الحث السطحي في التعليق، وينظر إلى النمو الاستعماري لتظهر بعد وقت قصير من مطلية الهيئات الجنينية على نوع الكولاجين أربعة ومصفوفة لامينين-521 في التمايز المتوسط.
في غضون 21 إلى 25 يوما من التمايز، تشكل الخلايا طبقات متجانسة اخلطية، مع مورفولوجيا مضلعة، وهذا هو نموذجي للخلايا الظهارية. قد تكون الخلايا ثم كرية تخزينها لاستخدامها في وقت لاحق، كما يتم الحفاظ على قابلية البقاء ومورفولوجيا جيدا بعد ذوبان. في اليوم 24 من التمايز، والغالبية العظمى من الخلايا أعرب عن البروتين مربع الاقتران، PAX6، المنظم الرئيسي لتطوير العين، فضلا عن p63 ألفا، علامة LESC المعترف بها على نطاق واسع.
دلتا Np63 هو coexpressed في معظم الخلايا الإيجابية p63 ألفا, مؤكدا على أكثر القرنية المحددة Np63 ألفا خلية النمط الظاهري. يتم التعبير عن علامات أخرى في جزء منه ، في حين أن علامات أخرى لا يمكن اكتشافها في هذه المرحلة ، مما يشير إلى أن التمايز قد تقدم نحو النسل الظهاري الطرفي غير القادر ، ولكن التمايز النهائي في الخلايا الظهارية القرنية الناضجة لم يحدث بعد. في المتوسط، كل تغذية غير متمايزة الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية متعددة القدرات يولد 0.7 الخلايا بحلول اليوم 25.
يمكن توقع 65٪ على الأقل دلتا Np63 ألفا السكان خلية إيجابية من قبل يوم 24. الحفظ بالتبريد يُنقي المزيد من عدد الخلايا. وعموما، فإن الأساليب المعروضة هنا بسيطة نسبيا، ولكن هناك بعض النقاط الحاسمة للنجاح.
جودة عالية من المواد بدءا أمر ضروري، فضلا عن لطيف، وتقنيات ثقافة الخلية بطلاقة بشكل عام. يوفر هذا البروتوكول وسائل قوية لإنتاج الخلايا الجذعية الظهارية الطرفية للتطبيقات السريرية، وكذلك لأغراض بحثية مختلفة. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل طريقة بسهولة للتمايز من خلايا الشبكية الظهارية الصباغ.
