Name: identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay
Uploaded: 2018-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

ونحن نشكر الدكتور ديفيد كينغ، معهد هاوارد هيوز الطبي، جامعة كاليفورنيا في بيركلي لتحليل الطيف الكتلي وتعليقات مفيدة. ونحن نشكر الدكتور تشو شوليان، شانغهاي، معاهد "العلوم البيولوجية"، والأكاديمية الصينية للعلوم، شنغهاي، الصين لتوفير بنية سينب إف كاملة طول. وأخيراً، نشكر الدكتورة سوزان لعنة، والدكتور ريان كالاهان، والدكتور كريستوف جريوير في جامعة بنغهامتون للحصول على المعدات. تم تمويل هذا البحث من "مؤسسة البحوث" لجامعة ولاية نيويورك، وقسم الكيمياء، "الدولة جامعة نيويورك" في بنغهامتون.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

لدينا الإنزيم كيناز في المختبر هو وسيلة قوية جداً لتحديد أهداف جزيئية كيناز Cdk1، الذي هو وحدة تحكم رئيسية لدورة الخلية وينظم العديد من العمليات الخلوية الهامة. الأسلوب يحدد إذا كان بروتين المنقي هو ركيزة ل Cdk1، ويسمح لتحديد مواقع محددة الفسفرة. وهذا يسهل الدراسات الميكانيكية لتنظيم ال...

مؤنزم هي الإنزيمات التي نقل مجموعات الفوسفات من ATP على ركائز وتنظيم العديد من العمليات الخلوية. هذا الفسفرة يتم عكسها وسريع، يضيف تهمتين تتعلقان بالسلبية، ويخزن الطاقة الحرة وهو واحد من التعديلات بوسترانسلاشونال الأكثر شيوعاً المستخدمة من قبل الخلايا. Cdk1، ويعرف أيضا باسم دورة انقسام الخلية البروتين 2 هومولوج (cdc2) وحدة تحكم رئيسية لدورة الخلية في جميع حقيقيات النوى1،2،3،،من45، وفوسفوريلاتيس ما يقدر 8-13 ٪ من البروتين6،7.
في حين حددت الدراسات البروتين مؤخرا العديد من المواقع الفسفرة في البروتينات، في معظم الحالات، كيناز المسؤولة عن هذه التعديلات غير معروف. هو عدد أهداف Cdk1 المعروفة، لا سيما في الخلايا البشرية منخفضة7. تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة المهم، كما أنها تمكن الدراسات الميكانيكية التي تحدد كيف يتحكم Cdk1 دورة الخلية. تنظيم دورة الخلية مهم للعزل الصبغي المؤمنين وانقسام الخلية، وتحتاج إلى عدد هائل عمليات الخلوية تحدث لدعم هذه الوظيفة الفسيولوجية الهامة. وهذا يشمل وقف النسخ والترجمة قبل ظهور الانقسام، فضلا عن إعادة تنظيم هائلة في البنية الخلوية والمنظمة، مثل التفكيك النووي المغلف والتكثيف كروموسوم، والجمعية المغزل التفتلي. التحرر من القيود والأخطاء في هذه العمليات تسبب السرطان أو العيوب الخلقية أو موت الخلية الانقسامية. كانت مثبطات محددة من Cdk1 مثل رو-33068من البلدان المتقدمة النمو، التي توفر أدوات قوية للدراسات الفنية، وبعض من هذه الموانع حاليا في التجارب السريرية لعلاج السرطان (انظر9 للاستعراض).
هنا، يمكننا وصف في المختبر كيناز مقايسة التي تتيح تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة. في هذا التحليل، يستخدم ب Cdk1/cyclin البشرية المتاحة تجارياً فوسفوريلاتي هدف تنقية بروتين في المختبر. الفسفرة الركازة يزيد وزنها ويضيف تهمتين تتعلقان بالسلبية؛ ولذلك، يؤكد الفسفرة ناجحة تحول صاعد من الفرقة جل البروتين على الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. يتم تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة فيما بعد بتحليل الطيف الكتلي للبروتين في المختبر فوسفوريلاتيد. للمعونة مع التصميم التجريبي، نحن أيضا مراجعة الأدوات الحاسوبية ومراجع للتنبؤ بمواقع الفسفرة Cdk1 محددة من تسلسل البروتين. وعلاوة على ذلك، نحن أيضا وصف تنقية البروتوكولات التي تسفر عن البروتين عالية نقية ومتجانسة استعدادات مناسبة للمقايسة كيناز. وأخيراً، يجب التحقق من المواقع التي تم تحديدها الفسفرة بالدراسات الفنية، ومقايسة ربط بسيط يرد هنا لهذا الغرض. جنبا إلى جنب، هذا هو نهج قوية جداً غلة مواقع الفسفرة Cdk1 محددة وتمكن الدراسات الميكانيكية في كيف يتحكم Cdk110،،من711دورة الخلية. حيث يعتمد هذا الأسلوب على البروتينات المنقاة، فإنه يمكن تطبيقها على أي نموذج الكائن الحي وغلة نتائج يمكن الاعتماد عليها. مع ذلك، ينصح التحقق الوظيفية الفسفرة الحصول على مواقع في المختبر ، الخلايا لديها آليات تنظيمية إضافية في المكان، مثل التعديلات بوستترانسلاشونال أو الشركاء التفاعل التعريب الخلوية التي قد تجعل المواقع الفسفرة موجوداً أو لا يمكن الوصول إليها للاعتراف بواسطة Cdk1.
تسلم Cdk1 موقع الفسفرة توافق آراء الذي يتكون من (Ser/Thr-برو-X-ليز/Arg)، حيث X أي بقايا وأن سيرين أو ثريونين هو موقع الفسفرة. وأهمية خاصة للاعتراف بوجود برولين في الموقف + 1. وبالإضافة إلى ذلك، يفضل مخلفات الأساسية في المواقف + 2 أو + 3، مع معظم المواقع الفسفرة Cdk1 محددة تحتوي على Lys أو الأرجنتين في + 3 وضع6،12.
أحكام تنظم تفعيل Cdk1 ويؤدي إلى ظهور الانقسام1،2،3،،من45. نشاط مؤنزم cyclin تعتمد على بشكل عام يعتمد على ارتباطها مع متميزة سيكلينس (cyclin أ ب، ج، د والإلكترونية في البشر)، التي يتم التعبير عنها في تذبذب مستويات طوال دورة الخلية13. Cdk1 التعبير ثابت عبر دورة الخلية وتنظيم نشاطها يعتمد على ارتباطه بالوحدات الفرعية التنظيمية cyclin A و cyclin ب5،13،،من1415، كما فضلا عن تعديلات بوستترانسلاشونال. تشكيل المجمع ب Cdk1/cyclin مطلوب من أجل التنشيط كيناز5،15،،من1416،،من1718. في المرحلة G2، ترجم في سيتوسول ب cyclin واستيرادها إلى نواة حيث أنه يربط Cdk15،،من1415،16،،من1718؛ ومع ذلك، هو عقد ب Cdk1/cyclin المعطل الفسفرة في المخلفات Thr14 و Tyr15 مؤنزم المثبطة Cdk1 البشرية Myt1 (المرتبطة بغشاء تيروزين ثريونين محددة والمثبطة cdc2 كيناز) و Wee1، على التوالي19، ،من 2021. في أواخر المرحلة G2، ينشط نشاط المجمع ب Cdk1/cyclin كيناز ديفوسفوريليشن Thr14 و Tyr15 بدوره انقسام الخلية 25 الفوسفاتيز (cdc25) ويقوم بتشغيل بدء الانقسام12،14، 18 , 20 , 22 , 23-الفسفرة Thr161 مطلوب أيضا للتنشيط ب Cdk1/cyclin وهو توسط Cdk7، Cdk-تفعيل كيناز (الكعكة)18. تدهور ب cyclin في طور الصعود يحللها Cdk1، مما يتيح الخروج من الانقسام24،25. ولتفعيل ب Cdk1/cyclin عملية معقدة. يتم تنفيذ البروتوكول المعروضة هنا مع المتاحة تجارياً ب Cdk1/cyclin خلال المؤتلف من التعبير عن هذا التعقيد في خلايا الحشرات، وهو المنشط في فيفو مؤنزم الذاتية14،20 وما زالت نشطة في الدولة النقية. الناتج النشط، المؤتلف البشرية Cdk1/cyclin ب مناسبة في المختبر فحوصات كيناز.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة في السنترومير البشرية البروتين و (سينب-F)10. سينب-و هو بروتين كينيتوتشوري الذي يتواجد في النواة خلال الجزء الأكبر من الطور البيني (G1 و S-المرحلة) ويتم تصديره إلى سيتوسول في G2 المرحلة26،،من2728 في طريقة تعتمد على Cdk110، 11. التعريب النووية هو يمنحها أدى ثنائي26. يتم التعرف كنلس قبل α كاريوفيرين عامل النقل النووي، التي، جنبا إلى جنب مع β كاريوفيرين، ورانجدب، ويسهل استيراد البضائع أدى إلى نواة29. تصدير المواد النووية في مرحلة G2 يسر عبر مسار تصدير غير معروف10. بمجرد سينب إف تكمن في سيتوسول، يتم تجنيده للمغلف النووية والمجندين بدوره في30،دينين معقد البروتين السيارات31. هذا المسار هام لوضع نواة كل منها سينتروسومي خلال المراحل الأولية للجمعية المغزل التفتلي بطريقة تعتمد على دينين، هو أمر مهم للتوقيت الصحيح لدخول الانقسامية وعملية أساسية في الدماغ التنمية30،،من3132. بدءاً من مرحلة G2، سينب-و هو أيضا تجميعها في كينيتوتشوري حيث لديها أدوار هامة للمؤمنين كروموسوم الفصل27،،من2833،34،35 . خطوة تنظيمية أساسية من هذه المسارات يتم تصدير و سينب النووية في مرحلة G2، الذي يعتمد على10،Cdk111. يصف لنا هنا بروتوكولا لتحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة في أدى من سينب-f. تبطئ الطفرات فوسفوميميتيك من هذه المواقع النووية استيراد سينب-F، مما يوحي بأن ب Cdk1/cyclin ينظم مباشرة التعريب الخلوية وسينب من الفسفرة من أدى10.
وعموما، هذا الإنزيم كيناز في المختبر يسمح تحديد ركائز محددة للبروتينات المستهدفة Cdk1. منقي كيناز فوسفوريلاتيد في المختبر بمجمع ب Cdk1/cyclin المتاحة تجارياً ومواقع الفسفرة وفي وقت لاحق حددها الكتلي. تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة تدعم الدراسات الميكانيكية التي تكشف كيف يتحكم Cdk1 دورة الخلية.

<table><tbody><tr><td>2800 mL baffled Fernbach flask</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>benzamidine hydrochloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>bottletop filter</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (residues 2987 &amp;ndash; 3065) pGEX6P1 plasmid</td><td>Available upon request.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>chlorampenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L methionine</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td>125650010</td><td></td></tr><tr><td>desalting pipet tips: Zip tips</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>electrospray ionization Fourier transform ion</td><td>Bruker Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr><td>cyclotron resonance mass spectrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>electrospray ionization ion trap mass spectrometer</td><td>Bruker Amazon</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>FPLC system: &amp;Auml;kta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>glutathione agarose</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>glutathione, reduced</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>incubation shaker: multitron shaker</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>karyopherin &amp;alpha; pet-28a pres plasmid</td><td>Available upon request.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge 5418R, refrigerated</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (0.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 plasmid</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS protease: PreScission protease</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Phos-tag acrylamide</td><td>Wako Pure Chem. Ind.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>reduced gluthathione</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonifier: Branson S-250D sonifier</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>swing out rotor TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay

كيناز cyclin تعتمد على 1 (Cdk1) هو وحدة تحكم رئيسية لدورة الخلية في جميع حقيقيات النوى، وفوسفوريلاتيس ما يقدر 8-13 ٪ من البروتين؛ ومع ذلك، العدد الأهداف المحددة ل Cdk1، لا سيما في الخلايا البشرية لا يزال منخفضا. تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة المهم، كما أنها توفر الميكانيكية ثاقبة كيف يتحكم Cdk1 دورة الخلية. تنظيم دورة الخلية أمر حاسم للعزل الصبغي المؤمنين، والعيوب في هذه العملية المعقدة تؤدي إلى الكروموزومي والسرطان.
هنا، يمكننا وصف في المختبر كيناز مقايسة المستخدمة لتحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة. في هذا التحليل، بروتين المنقي فوسفوريلاتيد في المختبر بنجاح ب Cdk1/cyclin البشرية المتاحة تجارياً الفسفرة ما يؤكده الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، ويتم فيما بعد تحديد مواقع الفسفرة من الطيف الكتلي. ونحن أيضا وصف تنقية البروتوكولات التي تسفر عن الاستعدادات البروتين عالية نقية ومتجانسة مناسبة للمقايسة كيناز، ومقايسة ملزمة التحقق الوظيفية للمواقع المحددة الفسفرة، الذي يسبر التفاعل بين إشارة تعريب نووية كلاسيكية (أدى) وبه α كاريوفيرين مستقبلات النقل النووي. للمساعدة مع التصميم التجريبي، نقوم بمراجعة النهج للتنبؤ بمواقع الفسفرة Cdk1 محددة من تسلسل البروتين. معا هذه البروتوكولات الحالية اتباع نهج قوية جداً غلة مواقع الفسفرة Cdk1 محددة وتمكن الدراسات الميكانيكية في كيفية Cdk1 يتحكم في دورة الخلية. حيث يعتمد هذا الأسلوب على البروتينات المنقاة، يمكن تطبيقها على أي نموذج الكائن الحي وغلة نتائج يمكن الاعتماد عليها، خاصة عندما تقترن بخلية الدراسات الفنية.

أننا استخدمت مؤخرا في المختبر كيناز مقايسة (الشكل 1) لتحديد المواقع الفسفرة Cdk1 على حدة في جزء سينب-و التي تحتوي على أدى10. يمنح هذا الإشارة التعريب النووية من سينب-و خلال الجزء الأكبر من الطور البيني. في المرحلة G2، يتم تصدير سينب إف من النوا...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay at JoVE.com

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

يتم تنشيط في مرحلة دورة الخلية G2 كيناز cyclin تعتمد على 1 (Cdk1) وينظم العديد من المسارات الخلوية. نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة كيناز في المختبر مع Cdk1، مما يتيح تحديد المواقع الفسفرة Cdk1 على حدة لتحديد الأهداف الخلوية من هذا كيناز الهامة.

تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

18.5K Views.  State University of New York at Binghamton. يتم تنشيط في مرحلة دورة الخلية G2 كيناز cyclin تعتمد على 1 (Cdk1) وينظم العديد من المسارات الخلوية. نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة كيناز في المختبر مع Cdk1، مما يتيح تحديد المواقع الفسفرة Cdk1 على حدة لتحديد الأهداف الخلوية من هذا كيناز الهامة.

Video: Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

أوليغوببتيد مسابقة الفحص لتحديد موقع الفسفرة

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

تحديد ركائز كيناز CK2 الرواية باستخدام نهج بيوكيميائية تنوعاً

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

رصد كيناز والفوسفاتيز الأنشطة من خلال دورة الخلية التي Ratiometric الحنق

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biology

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

يعاير النشاط كيناز من LRRK2 في المختبر</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video