الهدف العام لهذا البروتوكول هو دراسة الملف الشخصي للأجسام المضادة للجليكان المتداولة في مصل الحيوانات الصغيرة باستخدام مجموعة غليكان المطبوعة القائمة على التكنولوجيا. هذا النهج لديه إمكانات في التشخيص المبكر والعلاج الصحيح في بعض الحالات المرضية حيث تلعب الأجسام المضادة ضد هياكل الجليكان دورًا مهمًا. الميزة الرئيسية مع هذه التقنية، هو إمكانية قياس في نفس الإعداد التجريبي مئات الأهداف الجليكان مع حساسية عالية جدا باستخدام الحد الأدنى من العينة.
لتحضير الصفيف الصغير، استخدم صفيف روبوتي غير جهة اتصال. يطبع ستة نسخ من 50 ملليمولار الجليكان و 10 ميكروغرام لكل ملليلتر السكريات و 300 ملليمولار PBS، وhH 8.5 على ن هيدروكسي 6 الشرائح الزجاجية المشتقة. تحتوي كل شريحة على أربع كتل مختلفة من subarrays المتكررة ست مرات.
يتم تشكيل كل subarray واحد من 112 البقع الجليكانات مختلفة بما في ذلك الضوابط. احتضان الشرائح في مربع الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. لمنع الصفائف الصغيرة، احتضان الشرائح لمدة 1 1/2 ساعة مع عازلة حظر في درجة حرارة الغرفة.
ثم غسل رقاقة الجليكول مع المياه النقية جدا وتجفيفه عن طريق الهواء. تحضير المخزن المؤقت واحد خلال المخزن المؤقت أربعة كما هو موضح في بروتوكول النص. لتحضير رقائق الجليكول وعيناتها، ضع صندوق التخزين مع الشرائح على الطاولة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
فتح مربع ونقل رقاقة الجليكول في غرفة الحضانة التي ينبغي أن تكون مكيفة بالفعل مع ورقة مرشح الرطب للحفاظ على نسبة ثابتة الرطوبة داخل الغرفة. وفي الوقت نفسه، تمييع مصل الفئران مع عازلة واحدة في أنابيب 1.5 ملليلتر. التجانس محلول المصل لمدة خمس ثوان مع خلاط دوامة.
بعد التجانس، احتضان المصل المخفف في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حمام مائي لتجنب تجميع الغلوبولين المناعي. ثم الطرد المركزي الأنابيب لمدة ثلاث دقائق في 10،000 مرة G و 25 درجة مئوية. جمع المابير وتجاهل أي المواد المترسبة.
ضع رقاقة الجليكول بعناية في غرفة الحضانة. احتضان ذلك مع ملليلتر واحد من العازلة ثلاثة للقضاء على أي مادة متبقية على سطح رقاقة الجليكول. لمدة 15 دقيقة، عند 25 درجة مئوية.
عقد رقاقة الجليكول في وضع عمودي، وإعادة غسله مع بعض قطرات من العازلة ثلاثة باستخدام ماصة البسترة البلاستيكية. ثم، إزالة المخزن المؤقت بعناية من سطح رقاقة الجليكول باستخدام ورقة مرشح. ضع رقاقة الجليكول مرة أخرى في غرفة الحضانة.
نشر عينة مصل المخفف على سطح رقاقة الجليكول باستخدام ماصة صغيرة. تأكد من أن جميع المناطق الجافة من سطح رقاقة الجليكول مغطاة بعينة المصل المخفف باستخدام طرف الماصات. احتضان مع الانفعالات المدارية في 37 درجة مئوية لمدة 1 1/2 ساعة.
بعد الحضانة، وإزالة أي عينة الزائدة وتزج رقاقة الجليكول لمدة خمس دقائق في العازلة ثلاثة في 25 درجة مئوية. تمرير رقاقة الجليكول إلى وعاء مع العازلة أربعة وأخيرا، غسل رقاقة الجليكول مع المياه النقية جدا. جهاز طرد مركزي رقاقة الجليكول لمدة دقيقة واحدة في 175 مرة G و 25 درجة مئوية لإزالة السائل.
بعد وضع رقاقة الجليكول مرة أخرى في غرفة الحضانة، انتشار حل من الماعز المضادة للماوس مترافق إلى البيوتين على سطح رقاقة الجليكول. احتضان مع الانفعالات المدارية في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. إزالة كسر غير منضم وكرر خطوات الغسيل.
بعد الطرد المركزي، احتضان رقاقة الجليكول في الظلام في 25 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع اثنين من ميكروغرام لكل ملليلتر من محلول الفلوروكروم المسمى بالفلوروبتي الدين المقابل في العازلة الثانية. بعد العمل في الظلام لإزالة الكسر غير منضم وتكرار خطوات الغسيل، جفف رقاقة الجليكول عن طريق الهواء. لمسح الصفيف، اترك شريحة الجليكول على الطاولة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة في الظلام.
في الوقت نفسه، قم بتشغيل الماسح الضوئي للشرائح والليزر. عقد مجموعة صغيرة، الشريحة رقاقة الجليكول في فتحة حتى اللمسات على الظهر. مسح رقاقة الجليكول عن طريق تشغيل EasyScan وحفظ المسح الضوئي كملف tif.
كمي الصفيف باستخدام نظام تحليل ScanArray. افتح الصور الممسوحة ضوئيًا مسبقًا بالنقر فوق الملف في مجموعة التكوين و الملفات على النافذة الرئيسية. تحميل قالب ملف الصفيف المطابق في تنسيق GAL الذي يمثل ترتيب الجليكانات المطبوعة على الشريحة الزجاجية.
اضبط قالب GAL بمحاذاة الصفيف بعناية مع البقع الموجودة في الصورة ثم ابدأ القياس الكمي. حدد محيط القياس الكمي كما نوع الكم تشغيل سهلة كمية وطريقة القياس الكمي دائرة ثابتة. قم بـ"فك" كل الخيارات الخاصة بنقاط البحث التلقائي وحدد lowess لأسلوب الالتطبيع.
حفظ البيانات كميا كملف csv. نقل هذه البيانات إلى ملف جدول بيانات شائعة باستخدام Microsoft Excel أو تطبيق آخر مناسب. لا ينبغي اعتبار الفئران المتطابقة وراثياً مكافئة مناعية لأنها طورت أنماطاً مختلفة من الأجسام المضادة للكربوهيدرات الطبيعية.
كما هو موضح هنا، تم حفظ 12 خصوصيات غليكان فقط. يظهر هنا، هو مثال تمثيلي للصور التي تم الحصول عليها من رقائق صغيرة المسح باستخدام الماسح الضوئي فلورسنت. ثم تتم محاذاة الشبكة إلى البقع في كل صفيف فرعي واحد.
يتم الكشف عن الفلورسنت لكل بقعة ويتم نقل النتائج إلى ملف جدول بيانات شائع. بعد الحضانة مع مصل الماوس، تم مسح رقائق جليكو باستخدام قارئ صفيف المسح الضوئي. تم تحليل البيانات مع نظام تحليل المصفوفة الجزئية وتم التعبير عن النتائج في RFU على أنها متوسط زائد ناقص الانحراف المطلق المتوسط.
تمثل الألوان الزرقاء والبيضاء إشارات الربط الخلفية من 4000 RFU أقل من. يمثل اللون الأحمر إشارات الربط الموجبة أكبر من أو يساوي 4000 RFU. لم يتم التعرف على معظم هياكل الجليكان التي تتعرض في رقائق الجليكول من قبل ذخيرة من الأجسام المضادة للجلسان تعميم الفئران ج balp.
مرة واحدة يتقن هذه التقنية يمكن القيام به في خمس ساعات و 45 دقيقة إذا كان يتم تنفيذها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الطابعة غليكون مجموعة التكنولوجيا للتحقيق في ذخيرة ومستويات الأجسام المضادة للكربوهيدرات تعميم في عينات المصل. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن رقاقة جليكو يجب أن يتم التلاعب بها من قبل الجزء السفلي من النظارات الخفيفة.
حيث يوجد الباركود. وذلك لتجنب الاتصال مع glycans المطبوعة. أيضا، تأكد من أن جميع المساحة الجافة من رقاقة جليكو مغطاة بعينة مصل مخفف باستخدام غيض من الماصات.
حجم المطلوبة لتغطية تماما سطح واحد من رقاقة جليكو هو ما يقرب من ملليلتر واحد. بعد هذا الإجراء، يمكن القيام به أساليب أخرى مثل مجموعة تعليق قاعدة microsphere من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق الكشف متعددة مرنة من المضادة للجلايكان الأجسام المضادة الملف الشخصي. بعد إدخالها مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الجزيئات الحيوية والمناعة لاستكشاف التفاعل غير البروتين الجليكول في مجموعة من الحيوانات الصغيرة.
