أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا "معاهد لصحة الحيوان استخدام المبادئ التوجيهية الوطنية". وأيد هذا العمل جزئيا المنح المقدمة من "المعاهد الوطنية للصحة" (R01NS093073 و R21AA024873) لجيم قو.

<ol>
	<li>Niki&#263;, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis.">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 17, 495-499 (2011).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+degeneration+after+injury+and+in+development+by+the+endogenous+calpain+inhibitor+calpastatin.">Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin.</a> Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).</li><li>Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+in+the+axon.">Information processing in the axon.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 304-316 (2004).</li><li>Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+varicosity+initiation+in+central+neuron+mechanosensation.">Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation.</a> J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).</li><li>Chung, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+axonal+stretch+injury+in+vitro+induces+a+progressive+series+of+neurofilament+alterations+ultimately+leading+to+delayed+axotomy.">Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy.</a> J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).</li><li>Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin-A+treatment+attenuates+delayed+cytoskeletal+alterations+and+secondary+axotomy+following+mild+axonal+stretch+injury.">Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury.</a> Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+interruption+of+axonal+transport+due+to+microtubule+breakage+accounts+for+the+formation+of+periodic+varicosities+after+traumatic+axonal+injury.">Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury.</a> Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).</li><li>Donkin, J. J., Vink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cerebral+edema+in+traumatic+brain+injury:+therapeutic+developments.">Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments.</a> Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).</li><li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture.">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li><li>Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+stimulator+for+localized+cell+loading:+fabrication+and+strain+analysis.">Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis.</a> J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).</li><li>Lu, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS.">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).</li><li>Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+heterogeneity+of+the+rat+hippocampus+measured+by+atomic+force+microscope+indentation.">Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation.</a> J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).</li><li>Franze, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+branch+retraction+is+caused+by+a+threshold-dependent+mechanical+impact.">Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact.</a> Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).</li><li>Camp&#224;s, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell-generated+mechanical+forces+within+living+embryonic+tissues.">Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues.</a> Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يتم إجراء هذا الفحص ميكروبيوميتشانيكال على التوالي إلى الأمام. سوف ينتج نتائج يمكن الاعتماد عليها، إذا كانت جميع خطواتها تنفذ بعناية. وهناك العديد من الخطوات الرئيسية التي، إذا كان أداؤها غير سليمة، وسوف تعوق جمع البيانات الناجحة. تبدأ الخطوات الحاسمة المنبع للتطبيق الفعلي للتحفيز الوع?...

تشكيل فاريكوسيتي، أو تورم/الديكور، على طول محاور عصبية، سمة بارزة من نيوروديجينيريشن التي لوحظت في العديد من الاضطرابات أو إصابات الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك التصلب المتعدد، مرض الزهايمر، مرض باركنسون، والصدمات الدماغ إصابة1،2. وعلى الرغم من الآثار الفسيولوجية ل varicosities محواري في نشر إمكانيات العمل وانتقال متشابك3، كيف يتم إنشاؤها في فاريكوسيتيس لا يزال غير معروف. في الآونة الأخيرة، استخدام الإنزيم ميكروبيوميتشانيكال المنشأة حديثا في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف من القوارض، وجدنا أن المنبهات الميكانيكية يمكن أن تحدث فاريكوسيتيس في هذه الخلايا العصبية مع فضول ميزات عالية. أولاً، تحريض فاريكوسيتي السريع (< 10 ق) وهذه العملية لا يمكن عكسها بشكل غير متوقع. ثانيا، الشروع في فاريكوسيتي تعتمد على قوة ضغط النفخ: ارتفاع الضغط، والبدء بشكل أسرع. ثالثا، بدء فاريكوسيتي يعتمد على سن الخلايا العصبية. محاور عصبية من الخلايا العصبية الأصغر سنا تظهر أكثر استجابة للضغوط الميكانيكية، مقارنة بتلك الخلايا العصبية القديمة. رابعا، عرض النموذج فاريكوسيتيس على طول محاور عصبية الخلايا العصبية هيبوكامبال، بينما dendrites وشرائح إكسون الأولية من هذه الخلايا العصبية لا تغيير تحت نفس الشرط النفخ. وهكذا كشفت دراستنا سمة رواية من الأقطاب العصبية. هذه النتائج مع النظام في المختبر الناحية الفسيولوجية ذات الصلة. استخدام نموذج في فيفو لإصابات الدماغ الرضية خفيفة (mTBI)، واظهرنا أن varicosities محواري المتقدمة بطريقة تنسيق متعددة في قشرة somatosensory الفئران فورا بعد إغلاق الجمجمة أثر، اتساقا مع جهودنا في المختبر 4من النتائج. من المهم أن نلاحظ أن لدينا المصبوغة والتصوير من الفئران متبي توفر فقط رصاصة المفاجئة من التغييرات الشكلية العصبية، منذ أداء في فيفو الوقت الفاصل بين التصوير مورفولوجيا الخلايا العصبية خلال تأثير ميكانيكية لا تزال غير مجدية.
هذا نظام النفخ السائل أتاح لنا ليس فقط لالتقاط السمات الفريدة المرتبطة بتشكيل فاريكوسيتي الميكانيكية الناجمة عن الإجهاد، ولكن أيضا لتحديد الآلية الأساسية. عن طريق اختبار مختلف الحلول خارج الخلية، محصرات وفتاحات المرشحين مختلف قنوات أيون ميتشانوسينسيتيفي، والكهربية الخلوية، حددنا أن القناة الموجبة المحتملة عابر مستقبلات الفصيلية V الأعضاء 4 (TRPV4) القناة التي يسهل اختراقها إلى Ca2 + و Na+ وتنشيطه بواسطة النفخ المسؤولة أساسا عن الكشف عن الإجهاد الميكانيكية الأولى أثناء تشكيل محواري فاريكوسيتي4. وأكد كذلك مع نهج siRNA خروج المغلوب. أخذت معا، هذا النظام الجديد للمقايسة وقد وضعنا مع ثقافة العصبية هيبوكامبال، هو قيمة للغاية لدراسة خصائص ذبابة الخلايا العصبية المركزية، لا سيما في تركيبة مع تقنيات أخرى.
هذا النظام ذبابة أنشأنا فريد من نوعه ويختلف عن النظم الموجودة سابقا في عدة جوانب رئيسية. أولاً، تجربة الخلايا العصبية في هذا النظام، الخروج من الطائرة الإجهاد الميكانيكية في أشكال الضغط والقص. خلال تأثير الميكانيكية، لا تزال تعلق على السطح ساترة العمليات العصبية ولا تتحرك. وهذا يختلف عن سائر نظم تنطوي أساسا على الانحناء وتمتد في الطائرة التجريبية (أو التوتر)، على سبيل المثال، مثل الانحراف من محاور عصبية المجمعة نقل سلاسل5،6 أو تمتد محاور عصبية نمت في ميكروباتيرنيد القنوات والأغشية المط7،8. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن varicosities محواري يمكن أن يتسبب أيضا في هذه الاختبارات مثل في نظامنا النفخ السائل، بعملية في هذه الإعدادات يأخذ وقتاً أطول بكثير (من 10 دقيقة إلى عدة ساعات6،،من78) ويظهر لا رجعة فيه. وأخيراً، يسمح نظامنا استخدام النفخ السوائل المحلية دراسة السمات المكانية لتشكيل فاريكوسيتي (مثلاً.، dendrites، العمود الفقري الجذعية، سوما، الأجزاء الأولى محواري، محطات محواري)، إلى جانب ميزاته الزمانية. باستخدام هذا النظام، فقد اكتشفنا عدة غير متوقعة وفريدة من نوعها ميزات تكوين محواري فاريكوسيتي، وبخاصة السريعة الحدوث، وعكس بطيئة، وقطبية إكسون-تغصن.
النظام أن نناقش في هذه الورقة متوافق مع العديد من تقنيات جزيئية وخلية علم الأحياء. على سبيل المثال، لدراسة آثار الإجهاد الميكانيكي على مورفولوجيا الخلايا العصبية ودالة، يمكن استخدامه جنبا إلى جنب مع كوكولتوري المايلين، الوقت الفاصل بين التصوير الرنين الفلورسنت نقل الطاقة (الحنق) وانعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF)، تصوير الكالسيوم، وتسجيل المشبك التصحيح. في هذه الورقة، ونحن نركز على العناصر الأساسية للنظام. ثقافة العصبية هيبوكامبال والإعداد النفخ السائل، وتصوير مرور الزمن ذات الدقة العالية للنقل محواري وتصوير الكالسيوم موضحة خطوة بخطوة أدناه.

<table><tbody><tr><td>12 mm coverslips&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>64-0702</td><td>for 24-well plate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25 mm coverslips&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-545-102&amp;nbsp;</td><td>for 6-well plate&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rat tail collagen&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11 179 179 001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&amp;nbsp;</td><td>National Diagnostics&amp;nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Protease enzyme&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x (P/S)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Earle&#039;s Salts&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosylcytosine (Ara-C)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM media&amp;nbsp;</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>1854313</td><td>transfection reagent&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate rods&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>PG52151-4</td><td>for puffing pipette&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>rubber tubing&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>10cc plastic syringe and plunger</td><td>Becton Dickinson&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish (35 mm x 10 mm)</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Molecular Probes</td><td>F14201</td><td>for calcium imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mito-YFP construct&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>for cell transfection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>YFP-N1 construct&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>for cell transfection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Mcroscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x lens&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>062933</td><td>objective&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Apo TIRF 100x/1.49 oil lens&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>objective&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

a microbiomechanical system for studying varicosity formation and recovery in central neuron axons

Varicosities محواري هياكل الموسع على طول مهاوي من محاور عصبية بدرجة عالية من عدم التجانس. أنها موجودة فقط في العقول مع إصابات أو أمراض الأعصاب، بل أيضا في الدماغ العادي. هنا، نحن تصف نظام ذبابة المنشأة حديثا للحث على سرعة وموثوقية وعكسية محواري varicosities، مما يسمح لنا بفهم الآليات التي تحكم تشكيل فاريكوسيتي وتكوين البروتين غير متجانسة. ويمثل هذا النظام وسيلة مبتكرة لتقييم آثار إجهاد القص والضغط على الأقسام المختلفة سوبسيلولار من الخلايا العصبية، تختلف عن الأخرى في المختبر النظم التي تركز أساسا على تأثير تمتد. الأهم من ذلك، ونظرا للخصائص الفريدة لنظامنا، قدمنا مؤخرا اكتشاف رواية تبين أن تطبيق السائل المضغوط يمكن أن يستحث varicosities محواري من خلال تفعيل مستقبلات عابرة قناة المحتملة بسرعة وشكل قابل للعكس. ويمكن استخدام نظامنا النشاط الحيوي مريح في تركيبة مع نضح المخدرات وتصوير الخلايا الحية وتصوير الكالسيوم وتسجيل المشبك التصحيح. ولذلك، يمكن اعتماد هذا الأسلوب لدراسة قنوات أيون ميتشانوسينسيتيفي وتنظيم النقل محواري وديناميات cytoskeleton محواري، الكالسيوم إشارات وإصابة في الدماغ المتصلة بالصدمة التغييرات الشكلية.

قبل النفخ، تظهر محاور عصبية عادة تشكيل فاريكوسيتي قليلاً. النفخ التالية مع ضغط لدينا القياسية (190 mmH2س الارتفاع)، بدء محاور عصبية لتطوير العديد من مثل حبة فاريكوسيتيس. تشكيل فاريكوسيتيس عكسها جزئيا، كما هو موضح بمناطق إكسون تعود إلى حالتها قبل ينفخ بعد فترة استرداد 1...

Watch this Scientific Journal Video about A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons at JoVE.com

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

ويصف هذا البروتوكول نهج السائل المضغوط فسيولوجيا ذات الصلة لتحريض فاريكوسيتيس في الخلايا العصبية السريعة وعكسها.

نظام ميكروبيوميتشانيكال لدراسة تشكيل فاريكوسيتي والانتعاش في محاور عصبية من الخلايا العصبية المركزية

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

a-microbiomechanical-system-for-studying-varicosity-formation

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.2K Views.  The Ohio State University. ويصف هذا البروتوكول نهج السائل المضغوط فسيولوجيا ذات الصلة لتحريض فاريكوسيتيس في الخلايا العصبية السريعة وعكسها.

Video: A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

معالجة ميكانيكية من الخلايا العصبية للسيطرة على تطوير محواري

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

الليزر Nanosurgery من مخيخي محاور عصبية<em&gt; في فيفو</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

التصوير حيوي داخلي من محور عصبي التفاعل مع الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة في ماوس الظهرية الإصابات سحق العمود

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

ريويرينغ الخلايا العصبية: طريقة جديدة للتوسع نيوريت سريع والوظيفي اتصال الخلايا العصبية

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

A بسيطة العصبية الميكانيكية إصابة منهجية للدراسة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; موتور العصبون التنكس

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

نموذج إصابة المورفولوجية في فيفو لدراسة نيوروريجينيريشن في الطرفية والجهاز العصبي المركزي

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medicine

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

في الجسم الحي تقييم ديناميات Microtubule والتوجه في Caenorhabditis elegans الخلايا العصبية

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

توسيع مجموعة أدوات التصوير في الجسم الحي للنقل المحوري

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Inducing Axonal Varicosities with a Micromechanical Stimulus on Neurons

Source: Servello, D., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57202">A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the induction of axonal varicosities by applying micromechanical stimulus on neurons. The system comprises a micropipette attached to a syringe containing buffer via tubing. Using a micromanipulator, the micropipette is positioned above the neurons. Fluid pressure is then applied to induce varicosities in axons.

نظام ميكروبيوميتشانيكال لدراسة تشكيل فاريكوسيتي والانتعاش في محاور عصبية من الخلايا العصبية المركزية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

معالجة ميكانيكية من الخلايا العصبية للسيطرة على تطوير محواري

الليزر Nanosurgery من مخيخي محاور عصبية

ل

التصوير حيوي داخلي من محور عصبي التفاعل مع الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة في ماوس الظهرية الإصابات سحق العمود

ريويرينغ الخلايا العصبية: طريقة جديدة للتوسع نيوريت سريع والوظيفي اتصال الخلايا العصبية

A بسيطة العصبية الميكانيكية إصابة منهجية للدراسة

نموذج إصابة المورفولوجية في فيفو لدراسة نيوروريجينيريشن في الطرفية والجهاز العصبي المركزي

في الجسم الحي تقييم ديناميات Microtubule والتوجه في Caenorhabditis elegans الخلايا العصبية

توسيع مجموعة أدوات التصوير في الجسم الحي للنقل المحوري

إحداث الدوالي المحورية مع حافز ميكانيكي دقيق على الخلايا العصبية