C. Linn is supported by an NIH grant (NIH NEI EY022795).

وكانت جميع الإجراءات باستخدام المواد الحيوانية وفقا لمعايير معهد رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) في جامعة ميشيغان الغربية. 1. الحيوانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الذكور والإناث الفئران 3 أشهر من العمر في هذه الدراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حافظ على الحيوانات في 12 ساعة دورة الضوء / الظلام مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. </li></ol> 2. إعداد كوكتيل KAX للتخدير الحيوان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 50 ملغ من زيلازين (20 ملغ / مل) في 5 مل الكيتامين (100 ملغ / مل) مع 1 مل آسيبرومازين (10 ملغ / مل) و 3 مل من الماء المقطر. تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم مع فلتر حقنة وتخزين هذا الحل في زجاجة المصل 10 مل. </li></ol> 3. KAX حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن الحيوان (ز) والعودة إلى القفص لتصبح جاهزة للحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 0.1 مل KAX / 100 غرام من وزن الجسم الحيوان البريتونى، وذلك باستخدام حقنة 1 مل الانسولين مع إبرة 28 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماحللحيوان ليصبح فاقدا للوعي. تحقق ردود الفعل من قبل معسر القدمين والذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء جميع الحيوانات بأمان في المختبر لمدة الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الجراحة، محل الحيوانات في أقفاصها والحفاظ على راحة في RT حتى استعاد وعيه. العودة فقط الحيوانات إلى منشأة الحيوان عندما توقظ الحيوانات واستئناف السلوك العادي. </li></ol> 4. التحضير للجراحة والجمعية إبرة مجهرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل العقيمة 2 M كلوريد الصوديوم الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مجتذب مسرى مكروي (الشكل 1C) لسحب واحد 0.86 مم القطر الداخلي معيار مصقول الثقيلة ورقيقة أنبوب البورسليكات الجدران إلى قسمين microneedles زجاج مدبب ناعما (1D الشكل، الشكل 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ردم إبرة مجهرية واحدة من الخطوة السابقة مع 2 M المالحة باستخدام إبرة حقنة الردم وحقنة 1 مل (الشكل 1B). الاستفادة من فقاعات الهواء من طرف القطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الثانية حقنة 1 مل مع 2 Mكلوريد الصوديوم. توصيل إبرة G 18 ثم إرفاق طول (حوالي 10 بوصة) من البولي ايثلين أنابيب (الشكل 1A). استخدام المكبس حقنة لملء أنابيب البولي ايثيلين مع المياه المالحة من خلال إبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تمتلئ كل من إبرة مجهرية وأنابيب مع المياه المالحة، وربط بعناية الاثنين. القضاء على أي الهواء في اتصال بينهما (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطبة ناعما غيض من إبرة مجهرية عن طريق كشط أنها خفيفة جدا ضد حبة منشفة ورقية بالطبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق مقاومة إبرة مجهرية عن طريق دفع بلطف الغواص على حقنة حتى تيار غرامة السائل يمكن أن ينظر إليه على منشفة ورقية. يجب أن يكون تيار السائل لا تزيد اتساعا عن 0.5 مم. </li></ol> 5. إعداد الحيوان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 1-2 قطرات مخدر موضعي لالقرنية (بروباراكايين هيدروكلوريد العيون الحل، جامعة جنوب المحيط الهادئ، 0.5٪). انتظر حتى لا يحدث أي رد فعل العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم شعيرات مع مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Saturate قضيب من القطن طرف مع حل betadine ومنطقة مسحة حول العين التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر، ونعلق مرقئ لكبح الجفن السفلي لانتفاخ العين، وفضح الوريد فوق الصلبة وتقييد حركة العين. (الشكل 3، رأس السهم) </li></ol> 6. يحفز الزرق المالحة حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم إعداد التجمع إبرة مجهرية والحيوان، ويبدأ الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم تأكيد هذا الحيوان أن لا تستجيب لقرصة قدم / الذيل، ويخترق بعناية الوريد فوق الصلبة مع إبرة مجهرية التي تأتي في زاوية منخفضة بين 10 و 20 درجة إلى الوريد (الشكل 3، السهم الأبيض). وثقب ناجحة في الوريد هو واضح عندما يدخل الدم غيض من إبرة مجهرية (الشكل 3، السهم الأسود). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطء ويدويا ضخ ما يقرب من 50 المالحة ميكرولتر في الوريد. وهذا ينبغي أن يستغرق حوالي 10 ثانية. الأوردة سوف بلانش الأبيض والملح يدور ترولاف الأوعية الدموية (الشكل 4، رأس السهم). بعض المناطق من الحفاظ على مظهر الدم الحمراء (الشكل 4، السهم). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء الحقنة الثانية في الوريد، المقابل للموقع لأول مرة، لضمان الضرر الشبكية شامل لالشبكية طبقة الخلايا العقدية كاملة. ملاحظة: في غضون دقائق، وينبغي للمرء أن يرى مظهر غائم واضح من خلال قزحية العين كما يدور الملح من خلال نظام الأوعية الدموية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك العين المعاكس دون علاج لاستخدامها كعامل الرقابة الداخلية. </li></ol> 7. استعادة الحيوان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة مرقئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قضيب من القطن لتطبيق مرهم مضاد حيوي الثلاثي (باسيتراسين الزنك وكبريتات النيوميسين، polymysin ب كبريتات) إلى الموقع فرضت من قبل مرقئ ومواقع الحقن. لا يحدث تلف الأنسجة حول العين باستخدام مرقئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &gt; وضع تخدير الحيوانات في أقفاصها على تعميم بطانية المياه الدافئة إلى السابقانخفاض حرارة الجسم الأنف والحنجرة. إبقاء الحيوانات تحت الملاحظة حتى استعاد وعيه والسلوك العادي. نقل الحيوانات مستيقظا إلى مستعمرة الحيوانية. تبقى الحيوانات في المستعمرة حتى وقت التضحية. </li></ol> 8. التضحية الحيوانية وإزالة الشبكية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شهر واحد بعد إجراء للحث على الزرق، يصرح باستخدامها الحيوانات CO 2 الخنق وثقب الصدري الثانوي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في غرفة ووضع غطاء على بأمان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح CO 2 ومنظم الغاز صمامات للسماح حجم 20٪ / دقيقة CO 2 تهجير الأكسجين في الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح أربعة إلى 5 دقائق للحيوان أن تنتهي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف كل من الصمامات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحيوان من الغرفة وإجراء البزل الصدري الثانوي مع مشرط معقم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد القتل الرحيم، واستخدام مشرط لقطع النسيج الضام في تجويف المداري المحيطة بالعين، باينانوغرام الحرص على عدم قطع في مقلة العين نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية استخدام مقص الحافة المنحنية لقطع العصب البصري وأي نوع من الأنسجة المتبقية لاستخراج مقلة العين سليمة. وضع مقلة العين المستخرجة في 60 ملم × 15 ملم طبق بتري المتاح معقمة تحتوي على برنامج تلفزيوني جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم فنجان العين من مقلة العين. للقيام بذلك، وجعل شق صغير مع مشرط الخلفي فقط من الحدود بين القزحية والصلبة. اتبع هذا الشق حول محيط العين مع مقص الربيع صغيرة لإزالة نصف الكرة القرنية من مقلة العين. نصف الكرة متصلا العصب البصري لا يزال قائما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على وردي / شبكية العين البيج رقيقة جدا داخل فنجان العين من الحيوان الموت الرحيم. عقد طبقة الصباغية في شبكية العين مع ملقط أضعفت لتحقيق الاستقرار في فنجان العين. استخدام زوج آخر من ملقط مغلقة لندف بلطف جدا الشبكية سليمة كلها الخروج من الجزء الخلفي من العين. تجنب معسر، سحب، أو الجر شبكية العين مباشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص الربيع صغيرة لقطعالمنطقة التي لا تزال تعلق العصب البصري لشبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب التأكد من قطع أي الظهارة الصبغية المتبقية أو الأنسجة الصلبة من شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة نقل، ونقل بلطف جدا الشبكية معزولة إلى sylgard نظيفة المغلفة 35 ملم × 10 ملم طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني جديد. </li></ol> 9. إعداد كامل جبل الشبكية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في صحن sylgard، واستخدام الملقط والإبرة الصبار واحد دبوس الشبكية في مكانها. الحفاظ على طبقة الخلايا العقدية للشبكية مواجهة والعصب البصري إلى أسفل. شكل نصف كروي شبكية العين هو ملحوظ حتى بعد التثبيت. فإن انحناء شبكية العين حليقة نحو السقف عندما طبقة الخلايا العقدية للشبكية هي في الاتجاه المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقص صغير لقطع شبكية العين إلى أربعة أجزاء، مما يجعل شكل أربع أوراق البرسيم يشع من رأس العصب البصري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس الأرباع من شبكية العين مع الإبر الصبار إضافية لجعل شبكية العين شقة الإمكان withoالتحرير التوتر (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح شبكية العين معلقة في طبق sylgard مع 3 مل من 4٪ لامتصاص العرق O / N في RT. </li></ol> 10. تلوين الأجسام المضادة من شبكية العين ملاحظة: شبكية العين وصمة عار ثابتة مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية للعرض الخلايا العصبية في شبكية العين (الشكل 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الثابتة وشبكية العين، شنت مسطحة ثلاث مرات لمدة 2 دقيقة لكل منهما في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize شبكية العين مع 1٪ تريتون X-100 مع 1٪ مصل بقري جنيني في برنامج تلفزيوني لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف شبكية العين ثلاث مرات، 2 دقيقة لكل منهما، في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مرتين مع 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني، 5 دقائق لكل يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مرتين مع برنامج تلفزيوني، 5 دقائق لكل يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع 1٪ تريتون X-100 و 1٪ مصل بقري جنيني في برنامج تلفزيوني على RT لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مرتين مع 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني، 5 دقائق لكل يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مرتين مع برنامج تلفزيوني، 5 دقائق لكل يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان كل شبكية العين في 3 مل 1٪ مصل بقري جنيني في برنامج تلفزيونيمع الماوس المنقى مكافحة الفئران CD90 / الماوس CD90.1 (1: 300 تمييع) O / N في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف شبكية العين مرة واحدة مع 0.1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مرتين مع برنامج تلفزيوني، 5 دقائق لكل يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان كل شبكية العين في 3 مل برنامج تلفزيوني (أي FBS) مع الثانوية اليكسا فلور 594 الماعز المضادة للماوس مفتش (1: 300) O / N في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل شبكية العين مع برنامج تلفزيوني تحرري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح، وإزالة بعناية الإبر الصبار من شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بلطف شبكية العين على الشرائح المجهر مع ماصة نقل. تأكد من الحفاظ على التوجه مع الشبكية طبقة الخلايا العقدية التي تواجه إلى السقف. شكل نصف كروي شبكية العين هو ملحوظ حتى بعد التثبيت. فإن انحناء شبكية العين حليقة نحو السقف عندما طبقة الخلايا العقدية للشبكية هي في الاتجاه المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيعاب أي برنامج تلفزيوني الزائد مع KimWipe أو غيرها من المواد الماصة. يجب الحرص على عدم استيعاب شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 قطرات من الجلسرين ونصف و½ برنامج تلفزيوني من وزنها كما صباحاوسائل الإعلام ounting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية شبكية العين مع ساترة، وتجنب فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ساترة آمنة باستخدام طلاء الأظافر واضحة، والغراء، أو غيرها من المواد اللاصقة. </li></ol>

The authors have no conflicting or competing interests to disclose.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لإحداث ظروف شبيهة الزرق في الجسم الحي في نموذج الفئران. يستخدم هذا الإجراء حقن محلول ملحي مفرط التوتر للحث على تندب في الشبكة التربيقية 29، 32. تطوير ندبا تسبب انسداد تدفق الخلط المائي مما يزيد الضغط في الغرفة الأمامية. مع انخفاض تدف?...

الزرق هو مجموعة من الأمراض التي تؤثر على العين الخلايا العصبية في شبكية العين، وتحديدا، فإن خلايا الشبكية العقدة 1-2. المحاور من هذه الخلايا تلتقي ليصبح العصب البصري تحمل المعلومات البصرية إلى الدماغ حيث ينظر الرؤية. وبالتالي الأضرار التي لحقت RGCs والمحاور التي تسبب العيوب البصرية. الخصائص الأساسية المرتبطة بالاضطرابات الجلوكوما هي RGC الضمور والموت، وزيادة ضغط العين (IOP)، والحجامة القرص البصري وضمور. هذه الميزات تؤدي إلى فقدان البصر أو كامل، والعمى لا رجعة فيه. حاليا، وقد تسبب العمى الزرق في 70 مليون شخص في جميع أنحاء العالم 3. على هذا النحو، هو ثالث أكبر سبب في العالم للعمى 4. الآلية الدقيقة للوفاة RGC في الزرق لا تزال مجهولة. تم إجراء الكثير من البحوث إلى فك لغز. ومن المعروف، مع ذلك، أن عامل الخطر الرئيسي للزرق هو زيادة طن ضغط العين بسبب الدورة الدموية وعدم انتظام الخلط المائي (ه) في الغرفة الأمامية للعين. يعمل ه كبديل شفاف وعديم اللون للدم في الغرفة الأمامية اوعائية من العين. انها تغذي الخلايا المحيطة، ويزيل النفايات يفرز من عمليات التمثيل الغذائي والنقل الناقلات العصبية، ويسمح بتداول المخدرات وخلايا التهابية داخل العين أثناء الحالات المرضية 1. صيانة تداول الخلط المائي ينطوي على الجسم الهدبي والشبكة التربيقية. ويتم إنتاج الخلط المائي من الجسم الهدبي. ومن ثم يصب في الغرفة الأمامية للحفاظ على الصحة العامة للأنسجة العين. ويفرز 80٪ من تدفق الخلط المائي بنشاط من خلال ظهارة الهدبية غير صباغية عندما يتم تصفية السوائل من خلال ثلاث طبقات من الأنسجة الاسفنجية في العضلة الهدبية - 75. مخارج السوائل من خلال شبكه التربيقية ومن خلال قناة شليم التي استباقالمنشأ في نظام الدم 5. وتبقى 20 - 25٪ من تدفق تتجاوز الشبكة التربيقية ويفرز بشكل سلبي الترشيح الفائق ونشرها من خلال مسار-uveo صلبوي. يبدو أن هذا الطريق إلى أن تكون مستقلة نسبيا من ضغط العين 1. عندما إنتاج الخلط المائي وتدفق هم من التوازن، ويبني الضغط داخل العين. وكما ذكر، فإن هذه الزيادة في ضغط العين هو عامل الخطر الرئيسي في تطوير الزرق. يتسبب هذا الضغط الأضرار التي لحقت طبقات معقدة من الخلايا العصبية في الشبكية في الجزء الخلفي من العين. الأضرار التي لحقت محاور الخلايا الشبكية العقدة من العصب البصري يتسبب في الدماغ للم تعد تتلقى المعلومات البصرية دقيقة. ونتيجة لذلك، فقد تصور الرؤية ويمكن أن يحدث العمى الكامل. حتى الآن، لا يوجد علاج لزرق. توجد طرق العلاج المختلفة التي تهدف في المقام الأول إلى تقليل الضغط داخل العين. وتشمل هذه الموضعيةدروس الأدوية مثل حاصرات مستقبلات هرمون التوتر beta1، أو نظائرها البروستاغلاندين الموضعية. حاصرات بيتا تقلل من ضغط العين عن طريق تقليل إنتاج الخلط المائي 7. تعمل البروستاجلاندين للحد من IOP عن طريق زيادة تدفق الخلط المائي 8-14. تستخدم ألفا مستقبلات هرمون التوتر ومثبطات الأنهيدراز الكربونيك أيضا أساليب الثانوية من العلاج. ألفا مستقبلات هرمون التوتر زيادة تدفق من خلال مسار uveoscleral 15-17. مثبطات الأنهيدراز الكربونيك تقلل من إنتاج ه عن طريق تثبيط الأنزيمي 18. بكثير كما يجري استخدام إجراءات أكثر الغازية لعلاج الجلوكوما. ويستخدم الليزر رأب التربيق لزيادة تدفق الخلط المائي 19. العلاج الجراحي آخر، دعا trabeculectomy، ويخلق الموقع الصرف بديل لتصفية ه عندما يتم حظر مسار تربيقية التقليدي 20-21. من المعروف أن هذه خيارات العلاج لممثل المؤسسةectively تقليل الضغط داخل المقلة. ومع ذلك، ما يصل إلى 40٪ من المرضى الزرق تظهر مستويات IOP العادية مما يدل على الحاجة إلى أساليب علاجية أكثر اكتمالا. 22،23 بالإضافة إلى ذلك، في شبكية العين موت الخلايا العقدية ينظر في الزرق لا رجعة فيه بمجرد أن يبدأ والعلاجات الحالية لا تتوقف تطور المرض 24-28. وقد أبرزت هذه الحاجة لعلاجات اعصاب الفعالة التي تستهدف بقاء الخلايا العصبية نفسها. تطوير نماذج الزرق أمر حاسم لهذا التطور. في هذه الدراسة تظاهرنا وسيلة لإحداث آثار مثل الزرق في الفئران طويل ايفانز البالغين باستخدام إجراء تعديل المبينة في الأصل من قبل موريسون (29). في هذا الإجراء، والحقن من 2 M المالحة مفرط التوتر في الضفيرة الوريدية فوق الصلبة تحرض ظروف شبيهة الزرق التي تندب أنسجة للحد من تدفق مائي النكتة في الشبكة التربيقية مما يؤدي إلى زيادة في ضغط العين وخسارة كبيرة من RGCs ثithin شهر واحد من إجراء 30-31. إجراءات إحداث الزرق، مثل تلك المذكورة هنا، قد يكون المفتاح لفتح التطورات الجديدة في علاج الجلوكوما.

<table><tbody><tr><td>Xylazine hydrochloride, Minimum 99%</td><td>Sigma, Life Science</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride injection, USP, 100mg/ml&amp;nbsp;</td><td>Putney, Inc</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>10 ml bottle</td></tr><tr><td>Acepromazine Maleate, 10mg/ml</td><td>Phoenix Pharmaceutical, Inc</td><td>NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>Serum bottle, 10 ml</td><td>VWR</td><td>16171319</td><td>Borosilicate glass</td></tr><tr><td>1 ml insulin syringe&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD329410</td><td>28 G needle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>2 M Solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microelectrode Puller&amp;nbsp;</td><td>Narishige Group</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Polished Standard and Thin Walled Borosilicate Tubing&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>B150-86-10HP</td><td>without filament, 0.86 mm</td></tr><tr><td>Microfil syringe needle for filling micropipettes</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF28G</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge Luer-Lock needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>1130421</td><td>Syringe needle</td></tr><tr><td>Flexible Polyethylene Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>22046941</td><td>0.034 inch diameter, approximately 10 inches&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution, USP, 0.5%</td><td>Akorn, Inc</td><td>NDC 17478-263-12</td><td>15 ml&amp;nbsp; sterile bottle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Curved Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>StereoZoom 4</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat Clamp&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>1310912</td><td>curved edge</td></tr><tr><td>Triple Antibiotic Ointment&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0664481</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handle</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Disposable Petri Dish</td><td>VWR</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x Concentrate</td><td>Sigma, Life Science&amp;nbsp;</td><td>P7059-1L</td><td>1x dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (2), Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transfer Pipets, polyethylene, non sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>357524 or 52947-948</td><td>1 and 2 ml graduations</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Easy Grip Petri Dish&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Cactus Needles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>PX0055-3 or 818715.0100</td><td>Made into a 4% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T9284-100 ml</td><td>Made into both a 1% and 0.1% solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11150</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Purified Mouse Anti-Rat CD90/mouse CD90.1</td><td>BD Pharmingen</td><td>Cat 554892</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 goat anti-mouse&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A11005</td><td>1:300 dilution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2948-75x25</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>G5516-100 ml&amp;nbsp;</td><td>50% glycerol to 50% PBS, by weight&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Coverglass&amp;nbsp;</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>2975-225</td><td>Thickness 1 22 x 50 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>C2 Eclipse Ti</td><td></td></tr></tbody></table>

glaucoma-inducing procedure in an in vivo rat model and whole-mount retina preparation

الجلوكوما هو مرض يصيب الجهاز العصبي المركزي التأثير على الخلايا الشبكية العقدة (RGCs). محاور RGC التي تشكل العصب البصري تحمل المدخلات البصرية إلى الدماغ لالإدراك البصري. الأضرار التي لحقت RGCs والمحاور التي تؤدي إلى فقدان البصر و / أو العمى. على الرغم من أن السبب المحدد الزرق غير معروف، عامل الخطر الرئيسي لهذا المرض هو ضغط العين المرتفع. إجراءات إحداث الزرق في النماذج الحيوانية هي أداة قيمة للباحثين دراسة آلية الموت RGC. هذه المعلومات يمكن أن يؤدي إلى تطوير علاجات اعصاب الفعالة التي يمكن أن تساعد في الوقاية من فقدان البصر. يصف بروتوكول في هذه الورقة وسيلة لإحداث الزرق - مثل الأوضاع في نموذج الفئران في الجسم الحي حيث يتم حقن 50 ميكرولتر من 2 M المالحة مفرط التوتر في الضفيرة الوريدية فوق الصلبة. ابيضاض الأوعية يدل على نجاح الحقن. يؤدي هذا الإجراء فقدان RGCs لمحاكاة الزرق. شهر واحد بعدحقن، يتم التضحية الحيوانات وتتم إزالة العينين. بعد ذلك، يتم إزالة القرنية، العدسة، وزجاجي لجعل فنجان العين. غير المقشر ثم شبكية العين من الجزء الخلفي من العين ويعلق على أطباق sylgard باستخدام الإبر الصبار. عند هذه النقطة، الخلايا العصبية في شبكية العين يمكن أن تكون ملطخة لتحليلها. وتظهر النتائج من هذا المعمل أن ما يقرب من 25٪ من RGCs فقدت خلال شهر واحد من إجراء بالمقارنة مع الضوابط الداخلية. يسمح هذا الإجراء للتحليل الكمي من شبكية العين موت الخلايا العقدية في الجسم الحي في الفئران نموذج الزرق.

يوضح هذا القسم مكونات الأجهزة والإجراءات المستخدمة للحث على ظروف شبيهة الزرق في الجسم الحي في الفئران نموذج الزرق. نقدم لك مجموعة من الأدوات الفردية والمعدات المستخدمة لإجراء الحقن بالمحلول الملحي مفرط التوتر الذي يسبب زيادة في ضغط العين. نقد...

Watch this Scientific Journal Video about Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation at JoVE.com

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

الإجراءات في يحفز الزرق<em&gt; في فيفو</em&gt; نموذج الفأر وجبل لالجامع إعداد الشبكية

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

glaucoma-inducing-procedure-an-vivo-rat-model-whole-mount-retina

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

13.0K Views.  Western Michigan University. Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis. 

Video: Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

طرق التصوير المناعى والكالسيوم في Wholemount الجرذ الشبكية

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Neuroscience

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

منهجية للمحاكاة البيولوجية الكيميائية نيورومودوليشن من الفئران شبكية العين مع العصبي الغلوتامات في المختبر

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...

Bioengineering

A Magnetic Microbead Occlusion Model to Induce Ocular Hypertension-Dependent Glaucoma in Mice

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial neurodegenerative disease. With the advent of numerous transgenic mouse lines, there is increasing interest in inducible murine models of ocular hypertension. Here, we present an occlusion model of glaucoma based on the injection of magnetic microbeads into the anterior chamber of the eye using a modified microneedle with a facetted bevel. The magnetic microbeads are attracted to the iridocorneal angle using a handheld magnet to block the drainage of aqueous humour from the anterior chamber. This disruption in aqueous dynamics results in a steady elevation of intraocular pressure, which subsequently leads to the loss of retinal ganglion cells, as observed in human glaucoma patients. The microbead occlusion model presented in this manuscript is simple compared to other inducible models of glaucoma and also highly effective and reproducible. Importantly, the modifications presented here minimize common issues that often arise in occlusion models. First, the use of a bevelled glass microneedle prevents backflow of microbeads and ensures that minimal damage occurs to the cornea during the injection, thus reducing injury-related effects. Second, the use of magnetic microbeads ensures the ability to attract most beads to the iridocorneal angle, effectively reducing the number of beads floating in the anterior chamber avoiding contact with other structures (e.g., iris, lens). Lastly, the use of a handheld magnet allows flexibility when handling the small mouse eye to efficiently direct the magnetic microbeads and ensure that there is little reflux of the microbeads from the eye when the microneedle is withdrawn. In summary, the microbead occlusion mouse model presented here is a powerful investigative tool to study neurodegenerative changes that occur during the onset and progression of glaucoma.

Here, we present a protocol to induce ocular hypertension in the murine eye that results in the loss of retinal ganglion cells as observed in glaucoma. Magnetic microbeads are injected into the anterior chamber and attracted to the iridocorneal angle using a magnet to block the outflow of aqueous humour.

وميكروبيدات انسداد المغناطيسي نموذج للحث على بصري ارتفاع ضغط الدم التي تعتمد الزرق في الفئران

The use of rodent models of glaucoma has been essential to understand the molecular mechanisms that underlie the pathophysiology of this multifactorial ...

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their lifetime. NAION results in optic nerve edema, selective loss of the retinal ganglion cell neurons (RGCs) and atrophy of the optic nerve. A rodent model of NAION that expresses most NAION features and sequelae has been developed, which is applicable to both rats and mice. This model utilizes a focal laser application of 532 nm wavelength to illuminate a photoactive dye, Rose Bengal (RB), to cause capillary damage and leakage at the targeted anterior optic nerve (the laminar region). After rNAION induction, there is an early optic nerve ischemia, optic nerve edema, and intraneural inflammation, followed by selective RGC and axonal loss. Since the optic nerve is a CNS white matter tract, the rNAION model is applicable to mechanistic studies of selective white matter ischemia, as well as neuroprotective analyses and short and long-term mechanisms of glial and neuronal response to ischemia.

The Rodent Model of Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy rNAION

The following report describes how to replicate the rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (rNAION), using the appropriate dye, contact lens and laser parameters. We also reveal the appropriate steps for evaluating the rNAION lesion in vivo.

نموذج القوارض من Nonarteritic الإقفارية العصبي البصري الأمامي (rNAION)

Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy (NAION) is a focal ischemic lesion of the optic nerve that affects 1/700 individuals throughout their ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known risk factor for glaucoma. This protocol demonstrates a step-by-step guide on this technique in Long Evans rats and C57BL/6 mice. Under general anesthesia, a "purse-string" suture is applied on the conjunctiva, around the equator and behind the limbus of the eye. The fellow eye serves as an untreated control. Over the duration of our study, which was a period of 8 weeks for rats and 12 weeks for mice, IOP remained elevated, as measured regularly by rebound tonometry in conscious animals without topical anesthesia. In both species, the sutured eyes showed electroretinogram features consistent with preferential inner retinal dysfunction. Optical coherence tomography showed selective thinning of the retinal nerve fiber layer. Histology of the rat retina in cross-section found reduced cell density in the ganglion cell layer, but no change in other cellular layers. Staining of flat-mounted mouse retinae with a ganglion cell specific marker (RBPMS) confirmed ganglion cell loss. The circumlimbal suture is a simple, minimally invasive and cost-effective way to induce ocular hypertension that leads to ganglion cell injury in both rats and mice.

Chronic ocular hypertension is induced by applying a circumlimbal suture in rats and mice, leading to functional and structural deterioration of the retinal ganglion cells consistent with glaucoma.

نموذج زرق المستحث بخياطة سيركومليمبال في الجرذان والفئران

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

الكي الكامل الدائرة للضفيرة الوعائية الداكنة حول القزحية للزرق المستحث جراحيا في القوارض

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

التقييم الفسيولوجي المرضي للشبكية في نموذج الفئران

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

البرد الشبكية-الفروع، الجامع--يتصاعد، والتحضيرات ناقص التوتر المفرج معزولة للتصور المناعي من بيريسيتيس ميكروفاسكولار

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Biology

Transconjunctival Approach for Injection into the Rat Optic Nerve

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. Accessing the rat optic nerve for experimental manipulations and injections is challenging due to the small size of the orbit and the vascularity of the surrounding orbital tissues. Previous techniques have involved a cutaneous incision, which carries a higher risk of infection and requires wound closure. This study aims to describe a unique, less invasive, and potentially more efficient approach to accessing the rat optic nerve. A transconjunctival incision, along with a rat spinal cord hook, is used to isolate the optic nerve for experimental injections. In these experiments, an adenoviral vector is injected into the optic nerve with the goal of using this technique for direct gene therapy delivery in the future. This technique can also be applied by investigators requiring access to the rat optic nerve for other experimental studies, including drug delivery and optic nerve injury research.

This protocol describes a unique technique using a transconjunctival approach to access the rat optic nerve for injections.

نهج عبر الملتحمة للحقن في العصب البصري للفئران

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. ...

A Hypertonic Saline Injection Technique for Inducing Glaucoma in Rats

Source: Gossman, C. A. et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53831">Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates glaucoma induction in an anesthetized rat by injecting hypertonic saline into the episcleral vein. The saline enters the trabecular meshwork via Schlemm&#39;s canal, causing tissue scarring, which blocks aqueous humor outflow and raises intraocular pressure. The elevated pressure damages retinal ganglion cells, leading to glaucoma.

تقنية حقن المحلول الملحي مفرط التوتر لتحفيز الجلوكوما في الفئران

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

الإجراءات في يحفز الزرق

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video