This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.

بيان الأخلاق: كل هذه التجارب تتبع رعاية الحيوان ومبادئ توجيهية أخلاقية من جامعة نوتنغهام. 1. إعداد الهيبارين الخرز للتطعيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات الهيبارين بدقة في برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام. ملاحظة: يمكن تخزين حبات عند 4 درجة مئوية كما الطين في برنامج تلفزيوني. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار حبات لتطعيم عن طريق نقلهم من الأسهم مع ماصة 20 ميكرولتر إلى قطرة 1 مل من برنامج تلفزيوني. ثم استخدام micropipette معينة إلى 2 ميكرولتر لنقل الخرز إلى قطرة 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في طبق بتري 3 سم. اختيار حبات استنادا إلى حجم و، وذلك باستخدام جهاز ستيريو تشريح المجهر، ونقل حبات المختارة مع طرف P2 ماصة. تلك حوالي 100 ميكرون قطرها مثالية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBS من الخرز. إزالة معظم السائل مع 20 ميكرولتر ماصة والسائل المتبقي عن طريق عمل شعري مع الساعات غرامة ملقط. ملاحظة: من المهم لإزالة أكبر قدر ممكن حتى النمو الفعليلا المخفف ص عندما يتم إضافته إلى الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة عامل النمو مباشرة على الخرز. لFGF18 إضافة 0.5 ميكرولتر من FGF18 المؤتلف أعيد تشكيلها في 0.5 ملغ / مل في 0.1٪ BSA في برنامج تلفزيوني. ضع عدة قطرات من الماء حول حواف الطبق لمنع السائل من التبخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حبات لمدة 1 ساعة على RT. إزالة قطرات من الماء من الطبق مع ماصة باستور ووضعها على الجليد جاهزة للتطعيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر (لحبات شفافة) نقل 4-5 حبات إلى 2٪ الفينول الأحمر قبل التطعيم للمساعدة في تصور لهم. شطف في برنامج تلفزيوني قبل ان ينتقل الى الجنين. </li></ol> 2. إعداد AG الخرز 1-X2 للتطعيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخدام derivatize الخرز مع 0.2 N حمض الفورميك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للقيام بذلك استخدام ملعقة لنقل الخرز لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إضافة 1ml من 0.2 N حمض الفورميك وتغسل على منصة تهتز لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم إزالة حمض الفورميك مع ماصة P1000 واستبدالها مع 1مل من الماء. يغسل لمدة 1 ساعة وكرر ست مرات لإزالة ما تبقى من حمض الفورميك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة السائل المتبقي مع ماصة P1000 وتخزين حبات عند 4 درجات مئوية. ملاحظة: ليس من الضروري إزالة جميع المياه المتبقية في هذه المرحلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بيليه صغيرة من الخرز حوالي 5-10 حجم ميكرولتر من المخزون باستخدام ملعقة صغيرة في طبق بتري 3 سم وإضافة 1 مل من DMSO (أو أي مذيب يذوب الدواء في). ملاحظة: يجب أن توفر عدة مئات من الخرز من خلالها تحديد تلك من الحجم الصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم استخدم ماصة P2 معينة إلى 2 ميكرولتر لنقل حبات من حوالي 100 ميكرون قطرها إلى انخفاض 20 ميكرولتر من المذيب في طبق بتري آخر 3 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المذيب مع 20 ميكرولتر ماصة وأي مذيب المتبقية مع ماصة 2 ميكرولتر. استبدال 20 ميكرولتر من المخدرات ليتم تطبيقها. ملاحظة: للحصول على تناسق حل المخدرات في تركيز 100 ميكرومتر في DMSO (أو التي من أي وقت مضى تستخدم المذيبات)،قسامة 20 ميكرولتر وتخزينها في -80 ° C إلى بعض مثبطات جزيء صغير غير مستقرة وأنه من الأفضل لتجنب تكرار تجميد الذوبان. إذا لزم الأمر ثم تمييع المخدرات إلى التركيز المطلوب قبل تمرغ الخرز. قد تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا لكل المخدرات تركيزات فعالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 1 ساعة. حماية من الضوء حيث أن العديد من هذه الجزيئات خفيفة حساسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التطعيم نقل 4-5 حبات مع ماصة P2 معينة إلى 2 ميكرولتر في 20 ميكرولتر من 2٪ أحمر الفينول يذوب في الماء. تنفيذ هذه الخطوة باستخدام مجهر تشريح ستيريو لتصور الخرز. إزالة حبة واحدة مع الساعات غرامة ملقط أو حلقة الأسلاك وشطف في برنامج تلفزيوني قبل ان ينتقل الى الجنين. لا تترك حبات في 2٪ الفينول الأحمر لأكثر من 15 دقيقة قبل الاستخدام وهذا يمكن أن يسبب فقدان النشاط. </li></ol> 3. إعداد إبر التنغستن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أسلاك التنجستن ناعم إلى 3-4 أطوال سم. أدخل قطعة واحدة من السلك في نهايةماصة باستير الزجاج وتذوب في موقد بنسن لإصلاح في الموقف. إعداد ما يصل إلى 10 الإبر لضمان عدم وجود قطع الغيار إذا كانت معطوبة أثناء الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع نهاية السلك إلى لهب موقد اللحام والاحتفاظ بها هناك حتى يضيء التنغستن الأبيض وطرف حاد (حوالي 2-3 دقائق). ملاحظة: خلال استخدام الإبرة يمكن تنظيفها وإعادة شحذ في موقد اللحام حسب الحاجة. ملاحظة: يمكن أيضا أن هذه الإبر يمكن استخدامها لجعل الحلقات لنقل الخرز. تلمس برفق الإبرة إلى مقاعد البدلاء، وسوف ينحني لتشكيل حلقة. </li></ol> 4. الأجنة التحضير لالخرزة الطعوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض مع نهاية حادة تصل حتى يصلوا إلى المرحلة المطلوبة (3-5 أيام لمعظم التلاعب برعم الطرف). باستخدام الملقط حادة الحنفية على نهاية حادة لكسر قذيفة ثم استخدام ملقط لإزالة القشرة وفضح الجنين. ضمان غشاء قشر البيض تتم إزالة أيضا. ملاحظة: 1-2 مل من برنامج تلفزيوني ويمكن أن يضاف مع ماصة باستور للمساعدةهذا إذا العصي الغشاء إلى الصفار. بلطف ماصة PBS على سطح الصفار، فهم الغشاء مع ملقط، مع الحرص على عدم الإضرار صفار البيض، وسحب بلطف بعيدا عن البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ما يصل إلى 5 مل من الزلال من البيضة مع حقنة 10 مل و إبرة 19 G. يستغرق سوى بقدر اللازمة لضمان الجنين لا يجعل الاتصال مع الشريط تستخدم لختم البيض عن إزالة كميات أكبر يمكن أن تقلل من معدلات البقاء على قيد الحياة الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور الجنين إضافة 5-6 قطرات من الفنانين الحبر الهند إلى 15 مل من PBS تحتوي على 100 U البنسلين و 0.1 ملغ الستربتوميسين / مل. حقن 0.5-1 مل مباشرة تحت الجنين مع حقنة 1 مل و إبرة 25 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2-3 مل من برنامج تلفزيوني مع 1٪ مصل العجل الجنين و 100 U البنسلين و 0.1 ملغ الستربتوميسين / مل داخل البويضة لضمان الجنين لا يذوى. عن طريق شحذ الساعات ملقط إزالة الغشاء المحي وفتح السلى على براعم الأطراف النامية. ضمان الجنين لا تجف و، إذا لزم الأمر، إضافة المزيد من PBS / FCS. ملاحظة: براعم الأطراف يمكن رؤيتها بوضوح حيث الامتداد تقرن على الجناح الجنين. في هذه المراحل الجنين سوف تتحول مثل الجانب الأيمن عادة العلوي. ونتيجة لذلك فمن عادة أسهل في الكسب غير المشروع الخرز في أطرافه اليمنى واستخدام تلك اليسار والضوابط المقابل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام سلك التنغستن شحذ إلى إجراء شق في برعم الطرف حيث سيتم زرع حبة. تجنب قطع على طول الطريق من خلال برعم الطرف حيثما أمكن ذلك على الرغم من أن في مراحل الشابة وهذا أمر صعب. ملاحظة: في الأجنة القديمة (HH المرحلة 22 وما فوق) فمن الممكن لتحديد مناطق معينة من برعم الطرف للتطعيم ولكن في المراحل الشابة وهذا هو أكثر صعوبة كما برعم الطرف نفسها صغيرة. ومن المهم أيضا أن نتذكر أن برعم الطرف سينمو الماضي حبة المطعمة ذلك، وخاصة في المراحل الشابة، سوف تبقى حبة في الطرف القريب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط حبة من أي عامل النمو أو المخدرات باستخدام إما إضافي وا على ما يرامtchmakers ملقط أو حلقة مصنوعة من إبرة التنغستن. إذا كان قد تم غارقة حبة في أي DMSO أو الفينول الأحمر، وشطف في برنامج تلفزيوني قبل التقدم إلى الجنين. نقل حبة إلى الجنين مع ملقط / سلك حلقة. ثم استخدم سلك التنغستن شحذ لإدراج حبة في شق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-2 مل من PBS / FCS إلى البويضة التأكد من أن الجنين يتم الاحتفاظ رطب ولكن تجنب تطبيق مباشرة على الجنين نفسه وهذا يمكن أن يضر الأجنة وتسبب حبة يتم إقصاؤه. ختم البيض مع الشريط والعودة إلى الحاضنة. </li></ol>

<ol>
	<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li><li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology.">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> International Journal of Developmental Biology. 49, 85-103 (2005).</li><li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+embryo+as+a+model+to+study+the+development+of+the+neural+crest:+a+long+and+still+ongoing+story.">The avian embryo as a model to study the development of the neural crest: a long and still ongoing story.</a> Mechanisms of Development. 121, 1089-1102 (2004).</li><li>Bell, E., Brickell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-competent+retroviral+vectors+for+expressing+genes+in+avian+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Replication-competent retroviral vectors for expressing genes in avian cells in vitro and in vivo.</a> Molecular Biotechnology. 7, 289-298 (1997).</li><li>Abu-Elmagd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/Lef1+signaling+acts+via+Pitx2+to+regulate+somite+myogenesis.">Wnt/Lef1 signaling acts via Pitx2 to regulate somite myogenesis.</a> Developmental Biology. 337, 211-219 (2010).</li><li>Munsterberg, A. E., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+signals+from+the+neural+tube,+floor+plate+and+notochord+induce+myogenic+bHLH+gene+expression+in+the+somite.">Combinatorial signals from the neural tube, floor plate and notochord induce myogenic bHLH gene expression in the somite.</a> Development. 121, 651-660 (1995).</li><li>McGrew, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+germline+transgenic+chickens+using+lentiviral+vectors.">Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors.</a> EMBO Reports. 5, 728-733 (2004).</li><li>Valasek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+investigations+into+the+development+of+the+pectoral+girdle.">Cellular and molecular investigations into the development of the pectoral girdle.</a> Developmental Biology. 357, 108-116 (2011).</li><li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development.">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mechanisms of Development. 121, 1019-1029 (2004).</li><li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li><li>Tickle, C., Alberts, B., Wolpert, L., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+application+of+retinoic+acid+to+the+limb+bond+mimics+the+action+of+the+polarizing+region.">Local application of retinoic acid to the limb bond mimics the action of the polarizing region.</a> Nature. 296, 564-566 (1982).</li><li>Rosello-Diez, A., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulative+patterning+in+limb+bud+transplants+is+induced+by+distalizing+activity+of+apical+ectodermal+ridge+signals+on+host+limb+cells.">Regulative patterning in limb bud transplants is induced by distalizing activity of apical ectodermal ridge signals on host limb cells.</a> Developmental Dynamics. 240, 1203-1211 (2011).</li><li>Anakwe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+regulates+myogenic+differentiation+in+the+developing+avian+wing.">Wnt signalling regulates myogenic differentiation in the developing avian wing.</a> Development. 130, 3503-3514 (2003).</li><li>Amthor, H., Christ, B., Weil, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+timing+differentiation+during+limb+muscle+development.">The importance of timing differentiation during limb muscle development.</a> Current Biology. 8, 642-652 (1998).</li><li>Brand-Saberi, B., Muller, T. S., Wilting, J., Christ, B., Birchmeier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scatter+factor/hepatocyte+growth+factor+(SF/HGF)+induces+emigration+of+myogenic+cells+at+interlimb+level+in+vivo.">Scatter factor/hepatocyte growth factor (SF/HGF) induces emigration of myogenic cells at interlimb level in vivo.</a> Developmental Biology. 179, 303-308 (1996).</li><li>Mok, G. F., Cardenas, R., Anderton, H., Campbell, K. H. S., Sweetman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+FGF18+and+retinoic+acid+regulate+differentiation+of+chick+embryo+limb+myoblasts.">Interactions between FGF18 and retinoic acid regulate differentiation of chick embryo limb myoblasts.</a> Developmental Biology. 396, 214-223 (2014).</li><li>Abou-Elhamd, A., Cooper, O., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klhl31+is+associated+with+skeletal+myogenesis+and+its+expression+is+regulated+by+myogenic+signals+and+Myf-5.">Klhl31 is associated with skeletal myogenesis and its expression is regulated by myogenic signals and Myf-5.</a> Mechanisms of Development. , 126-852 (2009).</li><li>Schmidt, M., Tanaka, M., Munsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+(beta)-catenin+in+the+developing+chick+myotome+is+regulated+by+myogenic+signals.">Expression of (beta)-catenin in the developing chick myotome is regulated by myogenic signals.</a> Development. 127, 4105-4113 (2000).</li><li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1/2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification.">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li><li>Martinez-Morales, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+and+retinoic+acid+activity+gradients+control+the+timing+of+neural+crest+cell+emigration+in+the+trunk.">FGF and retinoic acid activity gradients control the timing of neural crest cell emigration in the trunk.</a> Journal of Cell Biology. 194, 489-503 (2011).</li><li>Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signals+provide+a+timing+mechanism+for+the+FGF-retinoid+differentiation+switch+during+vertebrate+body+axis+extension.">Wnt signals provide a timing mechanism for the FGF-retinoid differentiation switch during vertebrate body axis extension.</a> Development. 134, 2125-2135 (2007).</li><li>Logan, M., Simon, H. G., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+T-box+and+homeobox+transcription+factors+suggests+roles+in+controlling+chick+limb-type+identity.">Differential regulation of T-box and homeobox transcription factors suggests roles in controlling chick limb-type identity.</a> Development. 125, 2825-2835 (1998).</li><li>Borycki, A. G., Mendham, L., Emerson, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somite+patterning+by+Sonic+hedgehog+and+its+downstream+signal+response+genes.">Control of somite patterning by Sonic hedgehog and its downstream signal response genes.</a> Development. 125, 777-790 (1998).</li><li>Sweetman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-4+signaling+is+involved+in+mir-206+expression+in+developing+somites+of+chicken+embryos.">FGF-4 signaling is involved in mir-206 expression in developing somites of chicken embryos.</a> Developmental Dynamics. 235, 2185-2191 (2006).</li><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Developmental Dynamics. 220, 284-289 (2001).</li><li>Sweetman, D., Wagstaff, L., Cooper, O., Weijer, C., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migration+of+paraxial+and+lateral+plate+mesoderm+cells+emerging+from+the+late+primitive+streak+is+controlled+by+different+Wnt+signals.">The migration of paraxial and lateral plate mesoderm cells emerging from the late primitive streak is controlled by different Wnt signals.</a> BMC Developmental Biology. 8, 63 (2008).</li><li>Scott, B. B., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tissue-specific+transgenic+birds+with+lentiviral+vectors.">Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102, 16443-16447 (2005).</li><li>Seidl, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+quail+as+a+model+for+research+in+the+avian+nervous+system:+a+comparative+study+of+the+auditory+brainstem.">Transgenic quail as a model for research in the avian nervous system: a comparative study of the auditory brainstem.</a> Journal of Comparative Neurology. 521, 5-23 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

استخدام الطعوم حبة تطبيقها مباشرة على الأنسجة النامية في البيضة هو أداة قوية لتشريح دور عامل النمو الإشارات خلال تطوير يعطي سيطرة لا مثيل لها خلال المرحلة التنموية التي يتم تطبيقها ومدة التعرض. اختيار حبة لكل نوع من جزيء مهم. الج...

وقد وفرت أجنة الطيور أداة قوية لدراسة تطوير لسنوات عديدة 1. واحدة من خصائصها الأكثر فائدة هي أنها سهلة نسبيا للتلاعب. تنمية الخارجية يجعل من الممكن لفتح البيض للوصول إلى الجنين وأداء micromanipulations المختلفة بما في ذلك أمثلة مثل نظام الوهم السمان-فرخ الكلاسيكية لدراسة مصير خلية 2،3، وحقن الفيروسات القهقرية لoverexpression في أنسجة معينة أثناء نمو 4،5 والثقافة يزدرع لتحديد مصادر الإشارات التنموية 6. وفي الآونة الأخيرة الوهم ولدت بين المضيفين الخالي من الملصقات مع الطعوم من خط الدجاج المعدل وراثيا معربا عن GFP أظهرت أن الجمع بين التطعيم الكلاسيكية والتعديل الوراثي يمكن أن توفر معلومات هامة في التنمية 7،8. جعلت السهولة التي يمكن التلاعب بها الجنين الطيور يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة أطرافهمتنمية 9. وقد تم تطبيق عوامل النمو محددة لأطرافه النامية في الجسم الحي دورا أساسيا في تحديد العوامل التي تغير الطرف الزخرفة 10،11 ويستمر في تقديم رؤى في هذه العملية 12. كما تم استخدام هذا النهج لدراسة العوامل التي تنظم تنمية العضلات وكشفت عن العديد من الأدوار إشارات مثل Wnts 13، 14 أفضل الممارسات الإدارية وHGF 15. مؤخرا تم استخدام هذه التقنية للتحقيق في إشارات التحكم عضلي التعبير الجيني في برعم الطرف، وأظهرت أن التفاعلات بين FGF18 وحمض الريتينويك يمكن السيطرة على توقيت MyoD التعبير 16. باستخدام مزيج من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة التي يمكن تحميلها على حبات ثم المطعمة مباشرة إلى أنسجة معينة في مراحل نمو محددة يعطي فرصة للتدخل في أي وقت تقريبا والمنطقة خلال التنمية. وقد استخدم هذا إنفيstigate العديد من العمليات بما في ذلك الجسيدة الزخرفة 17،18، مواصفات العصبية 19، العصبية الهجرة قمة 20 و محور التمديد 21. نحن هنا تصف طريقة لتطعيم حبات غارقة في أي عوامل النمو أو مثبطات في تطوير أطرافه الدجاج. وقد استخدم هذا لتحديد آثار هذه الإشارات على تكون العضل عن طريق تحليل العضلات التعبير جين معين مع التهجين في الموقع. وصفنا ترقيع باستخدام الهيبارين غارقة الخرز، والتي تستخدم لعوامل النمو، أو AG الخرز 1-X2 لجزيئات صغيرة مسعور مثل حمض الريتينويك أو مثبطات جزيء صغير من مسارات إشارات محددة. ومع ذلك الخرز الأخرى المتاحة والتي تم استخدامها لتقديم كل عوامل النمو FGFs 22 و Shh على 23 أيضا.

<table><tbody><tr><td>Heparin acrylic beads</td><td>Sigma</td><td>H5263</td><td>The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,</td></tr><tr><td>AG 1-X2 beads</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1231</td><td></td></tr><tr><td>Affi Gel blue beads</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7301; 153-7302</td><td>These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads</td></tr><tr><td>FGF18</td><td>Peprotech</td><td>100-28</td><td>Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80&amp;deg;C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.</td></tr><tr><td>U0126</td><td>Cell Signalling</td><td>9903</td><td>Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80&amp;deg;C. Protect from light.</td></tr><tr><td>BMS-493</td><td>Tocris Biosciences</td><td>3509</td><td>Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80&amp;deg;C. Protect from light.</td></tr><tr><td>Black Indian ink</td><td>Windsor and Newton</td><td>5012572003384 (30 ml)</td><td>While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos</td></tr><tr><td>Tungsten wire, 0.1 mm dia. 99.95%</td><td>Alfa Aesar</td><td>10404</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS</td></tr></tbody></table>

grafting of beads into developing chicken embryo limbs to identify signal transduction pathways affecting gene expression

باستخدام أجنة الدجاج فمن الممكن لاختبار مباشرة آثار إما عوامل النمو أو مثبطات محددة من مسارات إشارات على التعبير الجيني وتفعيل مسارات نقل الإشارة. هذه التقنية تتيح إيصال إشارات الجزيئات في مراحل نمو محددة بدقة لأوقات محددة. بعد هذه الأجنة يمكن حصاده ودراسة التعبير الجيني، على سبيل المثال عن طريق التهجين الموضعي، أو تفعيل مسارات نقل الإشارة لاحظ مع المناعية في. في هذا الفيديو حبات الهيبارين غارقة في FGF18 أو AG الخرز 1-X2 غارقة في U0126، مثبط مجاهدي خلق، والمطعمة في برعم الطرف في البيضة. هذا يدل على أن FGF18 يدفع التعبير عن MyoD وERK الفسفرة وكلا الذاتية وFGF18 الناجم عن التعبير MyoD وتحول دون U0126. يمكن الخرز غارقة في خصم حمض الريتينويك تحفيز سابق لأوانه MyoD تحريض من قبل FGF18. هذا النهج يمكن أن يكون لناإد مع مجموعة واسعة من عوامل النمو المختلفة، ومثبطات وتتكيف بسهولة إلى الأنسجة الأخرى في الجنين النامي.

في مرحلة HH لم يتم أعرب 21 MyoD في تطوير myoblasts أطرافه على الرغم من تلطيخ يمكن أن ينظر إليه في بضعة عضلية من و somites النامية (الشكل 1A). ويبين الشكل 1B الموقع التهجين لMyoD 6 ساعات بعد الكسب غير المشروع FGF18 حبة. هو فعل MyoD في myoblasts قريبة من حبة في حين لي?...

Watch this Scientific Journal Video about Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression at JoVE.com

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

مسمار الخرز في تطوير الدجاج أطراف الجنين لتحديد مسارات نقل الإشارة التي تؤثر على التعبير الجيني

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

grafting-beads-into-developing-chicken-embryo-limbs-to-identify

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.8K Views.  University of Nottingham. By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Video: Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

الأمثل<em&gt; السابقين البيضة</em&gt; التثقيف من الفرخ الأجنة إلى مراحل متقدمة من التطوير

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

وضع العلامات المزدوجة من خلايا كريست العصبية والأوعية الدموية داخل أجنة الدجاج باستخدام الفرخGFP تطعيم الأنبوب العصبي وكاروتشيانين صبغ DiI حقن

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead زرع الأجنة الزرد

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

وضع عامل النمو المغلفه الخرز على أجنة الدجاج المرحلة المبكرة

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Biology

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

Electroporations OVO في مرحلة الجنين سمو الدجاج 10

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness following surgical intervention are key experimental strengths. Mica plates were the first barriers used to prevent chick limb bud initiation1. Protocols that use aluminum foil as an impermeable barrier to wing bud or leg bud induction and or initiation are described. We combine this technique with bead placement lateral to the barrier to exogenously supply candidate endogenous factors that have been blocked by the barrier. The results are analyzed using in situ hybridization of subsequent gene expression. Our main focus is on the role of retinoic acid signaling in the induction and later initiation of the chick embryo fore and hindlimb. We use BMS 493 (an inverse agonist of retinoic acid receptors (RAR)) soaked beads implanted in the lateral plate mesoderm (LPM) to mimic the effect of a barrier placed between the somites (a source of retinoic acid (RA)) and the LPM from which limb buds grow. Modified versions of these protocols could also be used to address other questions on the origin and timing of inductive cues. Provided the region of the chick embryo is accessible at the relevant developmental stage, a barrier could be placed between the two tissues and consequent changes in development studied. Examples may be found in the developing brain, axis extension and in organ development, such as liver or kidney induction.

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

تطبيق الحواجز غير نفاذ جنبا إلى جنب مع المرشح عامل الخرز غارقة لدراسة إشارات الاستقرائي في الفرخ

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

مقايسة لتحريض العصبية في الأجنة الفرخ

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

وحيد الخلية في الأجنة ترنسفكأيشن الفرخ

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Chicken Recombinant Limbs Assay to Understand Morphogenesis, Patterning, and Early Steps in Cell Differentiation

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of developing tissues and organs. This process is actively maintained in adulthood. Cell differentiation is an ongoing process during the development and homeostasis of organs. Understanding the early steps of cell differentiation is essential to know other complex processes such as morphogenesis. Thus, recombinant chicken limbs are an experimental model that allows the study of cell differentiation and pattern generation under embryonic patterning signals. This experimental model imitates an in vivo environment; it assembles reaggregated cells into an ectodermal cover obtained from an early limb bud. Later, ectoderms are transferred and implanted in a chick embryo receptor to allow its development. This assay was mainly used to evaluate mesodermal limb bud cells; however, it can be applied to other stem or progenitor cells from other organisms.

Recombinant limbs are a powerful experimental model that allows for studying the process of cell differentiation and the generation of patterns under the influence of embryonic signals. This protocol presents a detailed method for generating recombinant limbs with chicken limb-mesodermal cells, adaptable to other cell types obtained from different organisms.

فحص الأطراف المؤتلفة للدجاج لفهم التشكل والتنميط والخطوات المبكرة في تمايز الخلايا

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

تحليل تمايز الخلايا ، والتشكل ، والتنميط أثناء التكوين الجنيني للدجاج باستخدام فحص الخرز المنقوع

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

مسمار الخرز في تطوير الدجاج أطراف الجنين لتحديد مسارات نقل الإشارة التي تؤثر على التعبير الجيني

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

الأمثل

وضع العلامات المزدوجة من خلايا كريست العصبية والأوعية الدموية داخل أجنة الدجاج باستخدام الفرخ^GFPتطعيم الأنبوب العصبي وكاروتشيانين صبغ DiI حقن