The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام UCSF المؤسسي. 1. الحفظ بالتبريد والتثبيت من الجنينية الماوس قلوب. 1.1) أداة إضافية تجميد قلوب الجنينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق بتري 3.5 سم و 7 ملم cryomolds مع الأمثل قطع درجة الحرارة (OCT) المتوسطة (انظر الجدول مواد). في غطاء الكيميائية، تبرد 2-methylbutane في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 30 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 10 سم بتري أطباق، 10 مل من برنامج تلفزيوني إلى 3.5 سم أطباق بتري، وإخضاع كافة أطباق بتري على الجليد. إعداد طبق واحد 10 سم والعديد من 3.5 سم أطباق في الماوس حاملا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الأجنة كما هو موضح سابقا 15، وأداء تشريح في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفترة وجيزة، الموت ببطء الأنثى الحامل باستخدام CO 2 الخدر وخلع عنق الرحم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في البطن، تشريح خارج الرحم عن طريق خفض السفن منظمة العمل العربيةنانوغرام انحناء الداخلي للرحم، ونقل الرحم إلى 10 سم طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الرحم بين كل الجنين ونقل للفرد 3.5 سم طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. عزل كل جنين كما هو موضح 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح تجويف التامور باستخدام ملقط غرامة، وإزالة القلب بعيدا عن الرئتين والأوعية الدموية عن طريق خفض في الشريان الأبهر، الوريد الأجوف السفلي، والأوردة الرئوية، ونقل إلى 3.5 سم بتري تحتوي على OCT الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح قلب تتوازن في أكتوبر لعدة ثوان، ثم نقل القلب إلى 7 ملم العفن تحتوي أكتوبر توجيه الجدار الأمامي للقلب إلى الجزء السفلي من القالب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بلطف القالب إلى سائل تبريد النيتروجين 2-methylbutane. والحرص على عدم السماح 2-methylbutane السائل للمس أكتوبر أو القلب. تجميد حتى أكتوبر صلبة بيضاء، ثم نقل القالب إلى دلو الثلج التي تحتوي على الثلج الجاف. الانتقال إلى الجنين المقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> WRا ف ب cryomolds في احباط وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للcryosectioning. </li></ol> 1.2) البديل: امتصاص العرق (PFA) تحديد، cryoprotecting، وأكتوبر تضمين قلوب الجنينية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الآبار من 12 بئر الأنسجة لوحة الثقافة مع 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج قلوب الجنينية كما هو موضح في 1.1.3. وضع كل القلب إلى تحتوي كذلك 4٪ PFA وإصلاح في 4 درجات CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotection: باستخدام ماصة نقل البلاستيك، وتتحرك كل قلب لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل تحتوي على 1.5 مل من 15٪ سكروز في برنامج تلفزيوني وتستنهض الهمم بلطف عند 4 درجات مئوية حتى يغرق القلب إلى أسفل الأنبوب (عدة ساعات لO / N ). نقل كل قلب إلى 1.5ml تحتوي على 1.5 مل أنبوب microcentrifuge من 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني وتستنهض الهمم بلطف عند 4 درجات مئوية مرة أخرى حتى يغرق القلب إلى أسفل الأنبوب (عدة ساعات لO / N). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة نقل البلاستيك، ضع قلب cryoprotected في أكتوبر والسماح لها تتوازنلعدة دقائق لإزالة السكروز الزائد، ثم نقل القلب إلى 7 ملم العفن تحتوي أكتوبر توجيه الجدار الأمامي للقلب إلى الجزء السفلي من القالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد القلب في أكتوبر عن طريق وضع القالب في أي سائل تبريد النيتروجين 2-methylbutane أو الثلج الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف cryomolds في احباط وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للcryosectioning. </li></ol> 2. Cryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحرارة إلى -17 ناظم البرد درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان cryomolds في غرفة ناظم البرد وتتوازن إلى درجة حرارة لمدة 15-20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس cryomold واستخدام ضغط لطيف لطرد كتلة القلب من العفن. توجيه الجدار الأمامي من القلب إلى الجزء العلوي من كتلة الأنسجة مصبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة كبير من أكتوبر على تشاك، وجبل كتلة القلب على انخفاض أكتوبر لتجميد على تشاك. الحفاظ على التوجه مثل أن الجدار الأمامي للقلب هو أبعد من تشاك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل تشاك والتي شنت انهكتلة الفن على حامل الكائن ناظم البرد. ضبط بحيث تكون زاوية من النصل هو 3-5 درجة بالنسبة للعينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع 10 ميكرون أقسام على الشرائح المجهر التي تم علاجها قبل مع طلاء موجبة الشحنة (انظر الجدول مواد). السماح ليجف تماما قبل تخزينها في -80 ° C. </li></ol> 3. المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأقسام الإضافية المجمدة، وإصلاح الأنسجة وpermeabilize في الأسيتون لمدة 10 دقيقة في غطاء الدخان في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأقسام الإضافية المجمدة وPFA الثابتة، واحتضان في برنامج تلفزيوني-0.1٪ تريتون X-100 لمدة 20 دقيقة لإزالة أكتوبر وpermeabilize أقسام PFA الثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة لمدة 45 دقيقة في 1X عازلة تمنع، مخففة في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام الأجسام المضادة الأولية ولدت في الماوس، واحتضان في حمار أو الماعز المضادة للماوس مفتش (H + L) أحادي التكافؤ فاب شظية المخفف 1: 100 في برنامج تلفزيوني-0.1٪ توين 20 لمدة 45 دقيقة في RT (انظر مناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في الأجسام المضادة الأولية أو الأجسام المضادة المخفف في 1X عازلة تمنع لمدة 2 ساعة على RT أوO / N عند 4 ° C (انظر جدول المواد / معدات التخفيفات محددة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في اليكسا الضد الثانوية فلور مترافق المخفف 1: 500 في عرقلة العازلة لمدة 2 ساعة على RT، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 1X ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في RT، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: احتضان في هويشت صبغ المخفف 1: 2،000 في برنامج تلفزيوني في RT (محمية من الضوء) لتسمية نوى، ثم شطف مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما بعد الإصلاح وصفت المقاطع في 1٪ PFA لمدة 1 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الشرائح في مكافحة تتلاشى المتوسطة (مع دابي إن لم يكن وصفت نوى بالفعل) عن طريق وضع قطرتين من المتوسط ​​على كل نهاية الشريحة ثم يغطى مع ساترة. ختم coverslips مع طلاء الأظافر. متجر محمية من الضوء في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للصورة. </li></ol> 4. متحد البؤر التصوير وتحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الأطوال الموجية المناسبة ليزر، وكاميرا، ومتحد البؤر المجهر المؤتمر الوطني العراقيluding المرحلة المحرك و z السيارات. اطلاق برنامج برامج التصوير. استخدام 405، 488، و 561 موجات الليزر لتصوير Hoechst-، اليكسا 488-، واليكسا أقسام 568-الملون، على التوالي. ملاحظة: انظر الجدول مواد لدينا الأجهزة والبرمجيات المواصفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الشريحة التحكم (ساترة إلى أسفل لمجهر مقلوب) على المسرح الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الهدف 4X (انظر الجدول المواد)، والعثور على عينة ومجال الاهتمام. التقاط صورة لاستخدامه كقاعدة الخريطة عندما التصوير في تضخم عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريحة، مما يجعل الحد الأدنى من التعديلات على مرحلة الشريحة. تغيير في الهدف الغمر 60X النفط (انظر الجدول المواد)، ووضع قطرة صغيرة من الزيت على الهدف، واستبدال الشريحة (ساترة لأسفل) على خشبة المسرح الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البحث عينة مرة أخرى. تعيين قوة الليزر، وقت التعرض، وbinning إلى المستوى المطلوب لكل قناة. ملاحظة: نحن نستخدم بشكل عام قوة الليزر 0.8، وقت التعرض كاميرا من 100 ميللي ثانية، وbinning من 2 (SEالمواد الإلكترونية الجدول للمعدات والبرمجيات مواصفات)؛ تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا لكل تجربة الإعدادات المثلى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تحديد الإعدادات المثلى، استخدم نفس الإعدادات لجميع أقسام الأنسجة داخل التجربة. استخدام الرسم البياني كثافة الإشارة إلى مدى شدة الأمثل لكل قناة (وسوف تستخدم هذه المعلومات لتحليل). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد كومة من الألف إلى الياء باستخدام وظيفة الشراء: اختيار القنوات المناسبة ليزر، ثم اختيار الحدود العليا والدنيا للض المكدس. اختر من الالف إلى الياء حجم الخطوة كومة التي هي واحدة نصف قيمة سمك شريحة البصرية التي يقدمها البرنامج. انقر على &quot;تشغيل&quot; لجمع الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام فيجي 16 أو برنامج مماثل لتحليل الصور. داخل فيجي، افتح الملف كومة Z لون مخصص خيار الوضع والقنوات تنقسم إلى نوافذ منفصلة مع. فتح &quot;ضبط السطوع / التباين&quot; أداة من صورة القائمة المنسدلة. داخل كل قناة، قوآخرون والأمثل مجموعة كثافة الرسم البياني يحدد في 4.5.1. تطبيق هذه النطاقات قناة لجميع مداخن ض يجري تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دمج القنوات الفردية في صورة مركبة واحدة باستخدام -الصورة&gt; القائمة المنسدلة اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء ض كومة بالارض من الصورة المركبة باستخدام -الصورة&gt; Stacks-&gt; القائمة مشروع ض. هذه الصورة ستكون أكثر إشراقا بكثير من صورة 3D. ضبط مجموعة كثافة الرسم البياني للالعينة الضابطة لتجنب oversaturation، وتطبيق نفس الإعدادات لالتجريبية بالارض ض المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد صورة 3D، استخدم لأول مرة -الصورة&gt; Stacks-&gt; القائمة مشروع 3D 17. اختر إما محور س أو ص محور الدوران. تعيين تباعد شريحة كما نفس العدد من ميكرون ويبلغ حجم ض خطوة المكدس. اختيار دوران إجمالي المطلوب وتعيين زيادة زاوية دوران إلى 1. ثم افتح صورة J عارض 3D من الإضافات القائمة المنسدلة. اختيار صورة مركبة ولدت في 4.8، كما عرض الحجم، وإعادة تعيينأخذ العينات عامل إلى 1 أو 2. </li></ol>

<ol>
	<li>Risebro, C. A., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+ventricles.">Formation of the ventricles.</a> The Scientific World Journal. 6, 1862-1880 (2006).</li><li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper.">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation research. 92, 133-135 (2003).</li><li>Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transitional+junction:+a+new+functional+subcellular+domain+at+the+intercalated+disc.">The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc.</a> Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).</li><li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+myofibril+assembly:+integrins+pave+the+way.+Nature+reviews.">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).</li><li>Kastner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+A+deficiency+and+mutations+of+RXRalpha,+RXRbeta+and+RARalpha+lead+to+early+differentiation+of+embryonic+ventricular+cardiomyocytes.">Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes.</a> Development. 124, 4749-4758 (1997).</li><li>Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+ventricular+trabeculation/compaction+and+the+pathogenesis+of+the+left+ventricular+noncompaction+cardiomyopathy+(LVNC).">Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC).</a> American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+of+alpha3beta1+integrin+isoforms+in+association+with+myofibrillogenesis+during+cardiac+myocyte+development+in+culture.">Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture.</a> Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).</li><li>Lu, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin+nexus+in+cultured+cardiac+myocytes.">The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes.</a> The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).</li><li>Schultheiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+distribution+of+subsets+of+myofibrillar+proteins+in+cardiac+nonstriated+and+striated+myofibrils.">Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils.</a> The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).</li><li>Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costameres,+focal+adhesions,+and+cardiomyocyte+mechanotransduction.+American+journal+of+physiology.">Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).</li><li>Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+novel+Xin+protein+to+the+adherens+junction+complex+in+cardiac+and+skeletal+muscle+during+development.">Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).</li><li>Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-RAP+expression+during+mouse+heart+development.">N-RAP expression during mouse heart development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).</li><li>Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cardiac+cytoarchitecture+in+the+developing+mouse+heart.">Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart.</a> Developmental biology. 289, 430-441 (2006).</li><li>Whitman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmoplakin+and+talin2+are+novel+mRNA+targets+of+fragile+X-related+protein-1+in+cardiac+muscle.">Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle.</a> Circulation research. 109, 262-271 (2011).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC. 11, 274 (2010).</li><li>Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+cadherin-binding+proteins+beta-catenin+and+plakoglobin+in+the+heart+leads+to+gap+junction+remodeling+and+arrhythmogenesis.">Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis.</a> Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nature. 7, 168-169 (2010).</li><li>Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+immunohistochemistry:+review+and+future+prospects+in+research+and+diagnosis+over+two+decades.">Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).</li><li>Risebro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+maintains+muscle+structure+and+growth+in+the+developing+heart.">Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart.</a> Development. 136, 495-505 (2009).</li><li>Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillogenesis+in+the+developing+chicken+heart:+assembly+of+Z-disk,+M-line+and+the+thick+filaments.">Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments.</a> Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ويجب تحديد أفضل تقنية تثبيت الأنسجة والتخفيف تجريبيا لكل الأجسام المضادة. في أيدينا، والإضافية تجميد متفوقة على PFA تثبيت لعدة مستضدات cardiomyocyte، بما في ذلك S-α-actinin، β-كاتينين، β1-إنتغرين، التروبوميوزين، تالين (لا يظهر) وN-كادهيرين. في المقابل، PFA تثبيت تؤدي إلى نتائج ممتازة لتنسيق التصاق كيناز (لا يظهر). وcrosslinks البروتين التي شكلتها PFA قد يخفي الحواتم والحد من الأجسام المضادة ملزمة؛ قد تكون هناك حاجة استرجاع مستضد في مثل هذه الحالات، وطرق لاسترجاع مستضد ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى 20. يمكن تخفيض تركيز PFA أو طول التثبيت للحد من حاتمة اخفاء، مع تحديد الظروف المثلى تجريبيا لكل الأجسام المضادة وعند كل مرحلة التطوير. ضوابط السلبية المناسبة ينبغي أن تستخدم عندما تميز الأجسام المضادة جديد أو متحولة القلب، بما في ذلك المصل قبل المناعة مثل مراقبة الأجسام المضادة الأولية و&quot;لا الأجسام المضادة الأولية&quot; التعاونntrol. استخدام الفئران خروج المغلوب هو السيطرة السلبية مثالية ولكن الفتك في وقت مبكر يمنع استخدامها للعديد من المنتجات الجينات درس هنا. استخدام كميات كافية لغمر تماما الشرائح التجريبية والضابطة في نفس حجب المناعي، الأجسام المضادة، وكان حلول غسل المهم كما كان هزاز لطيف من الشرائح خلال حضانة لضمان التعرض موحدة من الأقسام إلى حلول. هذا النهج التقليل من التغير التقني في تلطيخ بين الأقسام والشرائح ضمن التجربة. عندما يحد تكلفة حجم حل الأجسام المضادة، واستخدام عنق الرحم القلم للحد من تدفق حلول أبعد من أقسام الأنسجة والحفاظ على الشرائح في غرفة ترطيب أثناء حضانات طويلة. إذا الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس الابتدائي - وبالتالي الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس - يتم استخدامه، وخطوة حجب الثانية لتغطية المناعية الذاتية الماوس يكون الضرورية (الخطوة 3.4) لتقليل إشارة الخلفية غير محددة. المجهر ومعالجة الصور التقنيات الملائمة حاسمة لحصول على معلومات دقيقة بيولوجيا 21. الرسم البياني كثافة يشير توزيع بكسل في كل مستوى كثافة (0-65535 المستويات للحصول على صورة 16-بت) لكل لون. الخلفية، والسطوع، والتباين يمكن تعديلها عن طريق الدخول في عرض نطاق كثافة أن الأجنحة ذروة الرسم البياني. لإجراء مقارنات صحيحة بين الظروف، يجب استخدام نفس الإعدادات بين السيطرة والظروف التجريبية. يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوق بها لتحليل نضوج cardiomyocyte والتنمية في الأصلي الجنينية القلب الماوس. في حين غالبا ما يستخدم المناعي للبروتينات cardiomyocyte محددة للاحتفال العضلية خلال التنمية، دراسات قليلة توظف التقنيات التي تسمح تحليل عالية الدقة من هيكل ميوفيبريل وظهور أقراص مقحم وcostameres 12-14،22،23. هذه التقنية يمكن استخدامها لفي الخامستقييم ايفو الطفرات التي تسبب عيوب القلب التنموية، كوسيلة لتحديد التغيرات في cardiomyocyte النضج التي قد تسلط الضوء على آليات تشوهات هيكلية.

خلال التنمية، وانقباضات القلب تبدأ قريبا بعد العضلية تهاجر إلى خط الوسط وتشكل الخطي أنبوب القلب 1،2. وsarcomere من وحدة مقلص الأساسية داخل cardiomyocyte. هذا الهيكل هيكل الخلية درجة عالية من التنظيم يحتوي على خيوط الأكتين ترتكز على Z-القرص الساركومير α-actinin (S-α-actinin) والألياف ميوسين ترتكز على خط M (الشكل 1). كما نضوج cardiomyocyte، sarcomeres تجميع في سلسلة لتشكيل اللييفات العضلية التي تمتد عبر الخلية. ترتكز اللييفات العضلية إلى أقاصي cardiomyocyte بواسطة القرص مقحم، وهيكل موصلي خلية خلية التي تحتوي على مفترق الانتقالي مع مجموعة فرعية من عناصر Z-القرص مثل S-α-actinin 3، الملتصقة البروتينات مفرق مثل N-كادهيرين وكاتينين β، والبروتينات الفجوة مفترق طرق، وdesmosomes (الشكل 1) 4. على طول الغشاء الطولي، وZ أقراص من اللييفات العضلية المحيطية أيضانعلق على غشاء الخلية عبر costameres. توفر هذه الالتصاقات البؤرية المتخصصة مرساة بين ميوفيبريل، غشاء البلازما، والمصفوفة خارج الخلية لتوفير الدعم الهيكلي إضافية إلى cardiomyocyte (الشكل 1) 4. في التنمية القلب في وقت مبكر، ويتم ترتيب العضلية في التوقعات تشبه الإصبع المعروفة باسم الترابيق التي تبرز في الفضاء البطيني ويتضمن myofibrils ناضجة نسبيا 5. مع استمرار التطور القلب، والعضلية في منطقة جنوب النخابية تتكاثر لتشكيل عضلة القلب المدمجة التي تضم جدران البطين، ولكن يتم تأخير قسيم عضلي والتجمع ميوفيبريل بالمقارنة مع عضلة القلب تربيقي 5،6. نماذج من قسيم عضلي والتجمع ميوفيبريل تأتي إلى حد كبير من الدراسات المناعي على العضلية مثقف 7-10، التي هي واضحة ولكنها تفتقر بيئة ثلاثية الأبعاد، وتدفق الدم، والاتصالات مع خلية أخرى في القلبحاضر في الجسم الحي. الدراسات البنيوية عالية الدقة باستخدام المناعي في قلب فأر الجنينية هي صعبة من الناحية الفنية، واستكشفت دراسات قليلة على ظهور أقراص مقحم وcostameres خلال الماوس تنمية القلب. البروتين الملتصقة تقاطع β كاتينين يبدو أن توطين على أقراص مقحم بعد يوم الجنينية (E) 17.5 11، N-كادهيرين يموضع إلى الهياكل الخطية التي قد تمثل أقراص مقحم من قبل E18.5 12 مقابل يوم بعد الولادة 0 13، كما تم الكشف عن costameres في E18.5 14، ولكن هذه البروتينات عرض توزيع غشاء منتشر وأكثر مستمر في وقت سابق النقاط الزمنية التنموية 11-13. هنا، نحن تصف طريقة واضحة وقابلة للتكرار لالمناعية والمجهري مضان من الفأر مقطوع قلوب الجنينية التي تسمح لتحليل مفصل لميوفيبريل والتنمية cardiomyocyte، بما في ذلك ظهور intercalaتيد أقراص أقرب وقت E12.5 وcostameres الوليدة في E16.5. قد يكون هذا البروتوكول مفيد لبحث آثار الطفرات على تشكيل قسيم عضلي وكذلك ميوفيبريل وcardiomyocyte النضج.

<table><tbody><tr><td>Cryomold, Disposable Base Mold, 7x 7 mm</td><td>Richard-Allen Scientific</td><td>58949</td><td>This size not available from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Cryomold, Disposable Base Mold, 15 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-159</td><td>Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td>Use fresh 4% solution in 1x PBS, pH 7.2-7.4.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Use 15% and 30% solutions in 1X PBS.</td></tr><tr><td>Disposable transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>&quot;Plus&quot; indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide.</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Western Blocking Agent</td><td>Roche</td><td>11921673001</td><td>Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1x in PBS.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.</td></tr><tr><td>Anti-s-&amp;#945;-actinin antibody</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;catenin antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>9587s</td><td>Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400.</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;1 integrin antibody</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF2405</td><td>Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td></tr><tr><td>Anti-tropomyosin antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td><td>CH1</td><td>Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td></tr><tr><td>Anti-N-cadherin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7939</td><td>Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td></tr><tr><td>Anti-talin antibody</td><td>Sigma</td><td>T3287</td><td>Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td></tr><tr><td>Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody</td><td>Invitrogen</td><td>700255</td><td>Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 dye</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>Nuclear stain</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box</td><td>Keysight (formerly Agilent)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clara Interline CCD camera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti inverted microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat 4X air objective</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm</td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602)</td><td>Nikon&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>NA 1.4, WD 0.13 mm</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements Imaging Software</td><td>Nikon</td><td>http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Fiji</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart

أثناء نمو القلب، وتوليد وحدات عضلة القلب محددة الهيكلية والوظيفية بما في ذلك sarcomeres، اللييفات العضلية مقلص، وأقراص مقحم، وcostameres يتطلب التجمع المنسق لمكونات متعددة في الزمان والمكان. اضطراب في تجميع هذه المكونات يؤدي إلى عيوب القلب الخلقية. وتستخدم تقنيات تلطيخ مناعي عادة في العضلية مثقف للتحقيق النضج ميوفيبريل، ولكن هذا النهج خارج الحي محدودة من قبل إلى أي مدى سوف myocytes تفرق تماما في الثقافة، ونقص المدخلات الطبيعية في الجسم الحي الميكانيكية، وغياب العظة الشغافية. تطبيق تقنيات المناعي لدراسة وضع الماوس القلب هو مرغوب فيه ولكن أكثر تحديا من الناحية الفنية، وأساليب غالبا ما تفتقر حساسية كافية وقرار لتصور sarcomeres في المراحل الأولى من التنمية القلب. هنا، نحن تصف طريقة قوية وقابلة للتكرار للمشاركة في immunostain موالبروتينات ltiple أو للمشاركة في تصور بروتين فلوري مع تلوين مناعي في قلب الفأر الجنينية واستخدام هذه الطريقة لتحليل اللييفات العضلية النامية، أقراص مقحم، وcostameres. هذه الطريقة يمكن تطبيقها أيضا على تقييم التغيرات الهيكلية cardiomyocyte التي تسببها طفرات تؤدي إلى عيوب القلب الخلقية.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart at JoVE.com

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

analysis-cardiomyocyte-development-using-immunofluorescence-embryonic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

21.1K Views.  Northwestern University. Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Video: Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, and allow for the study of the cellular and molecular basis of normal and abnormal cardiac morphogenesis. Recent emerging technologies of retrospective single clonal analyses make the study of cardiac morphogenesis at single cell resolution feasible. However, tissue opacity and light scattering of the heart as imaging depth is increased hinder whole-heart imaging at single cell resolution. To overcome these obstacles, a whole-embryo clearing system that can render the heart highly transparent for both illumination and detection must be developed. Fortunately, in the last several years, many methodologies for whole-organism clearing systems such as CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB and PACT have been reported. This lab is interested in the cellular and molecular mechanisms of cardiac morphogenesis. Recently, we established single cell lineage tracing via the ROSA26-CreERT2; ROSA26-Confetti system to sparsely label cells during cardiac development. We adapted several whole embryo-clearing methodologies including Scale and CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis) to clear the embryo in combination with whole mount staining to image single clones inside the heart. The heart was successfully imaged at single cell resolution. We found that Scale can clear the embryonic heart, but cannot effectively clear the postnatal heart, while CUBIC can clear the postnatal heart, but damages the embryonic heart by dissolving the tissue. The methods described here will permit the study of gene function at a single clone resolution during cardiac morphogenesis, which, in turn, can reveal the cellular and molecular basis of congenital heart defects.

We describe a protocol to volumetrically image fluorescent protein labeled cells deep inside intact embryonic and postnatal hearts. Utilizing tissue-clearing methods in combination with whole mount staining, single fluorescent protein-labeled cells inside an embryonic or postnatal heart can be imaged clearly and accurately.

التصوير تطهيرها الجنينية وبعد الولادة قلوب في قرار وحيدة الخلية

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

تحليل الأوعية التاجية في قلوب الجنينية مسح

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

تصور التغيرات دورة الخلية وتحديد في النواة في ما بعد الولادة العضلية

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

تقييم Cardiomyocyte الأنواع الفرعية بعد إعادة برمجة بوساطة عامل النسخ من الفأر الجنينية الخلايا الليفية

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

تحليل لتطوير دائرة القلب أثناء Embryogenesis الماوس باستخدام كامل جبل ابيفلوريسسينسي

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Live Imaging of Early Cardiac Progenitors in the Mouse Embryo

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail specific developmental stages in a still snapshot, live imaging captures dynamic morphogenetic events, such as cell migration, shape changes, and differentiation, by imaging the embryo as it develops. This complements fixed analysis and expands the understanding of how organs develop during embryogenesis. Despite its advantages, live imaging is rarely used in mouse models because of its technical challenges. Early mouse embryos are sensitive when cultured ex vivo and require efficient handling. To facilitate a broader use of live imaging in mouse developmental research, this paper presents a detailed protocol for two-photon live microscopy that allows long-term acquisition in mouse embryos. In addition to the protocol, tips are provided on embryo handling and culture optimization. This will help understand key events in early mouse organogenesis, enhancing the understanding of cardiovascular progenitor biology.

We present a detailed protocol for mouse embryo culture and imaging that enables 3D + time imaging of cardiac progenitor cells. This video-toolkit addresses the key skills required for successful live imaging otherwise hard to acquire from text-only publications.

التصوير الحي لأسلاف القلب المبكرة في جنين الفأر

The first steps of heart development imply drastic changes in cell behavior and differentiation. While analysis of fixed embryos allows studying in detail ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining تشريح القلب الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Biology

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

العزلة وثقافة الأطفال حديثي الولادة ماوس العضلية

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...