وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم NSF-IOS المنحة الوطنية # 1144391 إلى البنك السعودي الهولندي.

1. إعداد النباتات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن نبتت بذور نبات الأرابيدوبسيس مباشرة على التربة أو على لوحات MS. تنمو النباتات لمدة أربعة إلى ستة أسابيع في غرف النمو مع الإضاءة 12 ساعة (22 ° C يوم، 15 ° C يلة 14). محطات المياه مرة واحدة إلى مرتين في الأسبوع. استخدام الدرج السفلي للسقي، لا محطات المياه من أعلى؛ تسمح الأدراج لتجف قبل إعادة سقي. التأكد من النباتات جيدا المائية في وقت الحصاد. </li></ol> 2. إعداد حلول والأطباق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> K-EDTA 2 الحل: إصنع ملي K-EDTA 2 الحل الحل 100 الأوراق المالية، والتي يمكن أن تبقى في الثلاجة. في يوم جمع وتمييع الحل 04:59 (جزء واحد EDTA حل، وأربعة أجزاء من الماء) للحصول على 20 ملي K-EDTA حل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كوب أو طبق بتري (قطر 7-15 سم) في منتصف الطريق مع ملي 20 K-EDTA حل 2. إذا جمع عينات من العلاجات المختلفة (لالسابقينمراقبة وافرة والنباتات المجهدة الملح أو المورثات مختلفة)، وإعداد أطباق منفصلة لكل معاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء العدد المرغوب فيه من 1.7 مل أنابيب رد فعل مع 1.4 مل من 20 ملي K-EDTA حل 2. ملء عدد متساو من أنابيب رد فعل مع 1.4 مل تعقيمها الماء منزوع الأيونات أو ميليبور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المناشف الورقية على مقاعد البدلاء لوضع النباتات على؛ الحصول على واحد شفرة حلاقة جديدة وضعت على قفازات. </li></ol> 3. جمع من اللحاء الإفرازات (كما هو مبين في المخطط الانسيابي في الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريدة الحصاد يترك من أربع إلى ست محطات من العمر الأسبوع بالقص مع شفرة حلاقة في قاعدة قريبة سويقات إلى وسط ريدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان على الفور يترك في الأطباق التي تحتوي على 20 ملي K-EDTA 2. تأكد من المغمورة نهاية قطع من سويقات في الحل (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم جمع 15 ورقة (حوالي 3-4 النباتات)، كومة الأوراق بلطف على أعلى من كل هذه ر الأخرىيتم محاذاة قبعة قطع أعناق مع بعضها البعض. Recut قاعدة أعناق (حوالي 1 ملم)، ونقل على الفور الأوراق إلى واحدة من أنابيب رد فعل مع ملي 20 K-EDTA حل 2. الأوراق تناسب أسهل إذا كانت وتوالت ارتفاعا طفيفا. تجنب الضغط على الأوراق في لأن هذا قد يسبب إصابة الخلايا، وبالتالي، ويؤدي إلى جمع المحتوى الخلية ورقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اذا كانت هناك حاجة المزيد من المواد، وتغطي بلطف عينات مع منشفة ورقية مبللة. استخدام مجموعة جديدة من الأطباق إذا لجمع عينات من العلاجات أو الأنماط الجينية المختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم وضع جميع العينات في أنابيب رد فعل، وجمع الإفرازات إما في الظلام أو في الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع في الظلام، خط الكلمة من طبق ضحل كبير مع مناشف ورقية مبللة. وضع رف مع أنابيب رد فعل ورقة مليئة في طبق وإما غطاء مع مناشف ورقية مبللة أو وضعها في عودة البلاستيك الأسود مع الشقوق للتهوية. وضع الإعداد كامل في خزانة أو غرفة مظلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع في ضوء، خط الجزء السفلي من وعاء شبكي واضحة مع مناشف ورقية مبللة. وضع رف مع أنابيب رد فعل ورقة مليئة في حاوية وإغلاقه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، إزالة الأوراق بلطف من الحاوية وأنابيب رد فعل ويغسل جيدا بالماء المقطر، منزوع الأيونات أو ميليبور لإزالة جميع EDTA. هذه الخطوة يخدم ثلاثة أغراض: (1) أنه يزيل EDTA إلى الضرر التقليل إلى الخلايا، (2) أنه يلغي تدخل من EDTA مع SDS-PAGE واللوني، و (3) يزيل أي المركبات التي تراكمت من قطع / التالفة الخلايا. نقل على الفور الى رد فعل أنابيب معدة تحتوي على الماء تعقيمها والعودة إلى حاويات جمع مرطب لجمع الإفرازات. في هذه المرحلة، إضافة ريبونوكلياز المانع إذا احتاج الافرازات لاستخدامها في استخراج الحمض النووي الريبي. اختياري: يمكن إضافة مثبطات بروتين إذا كان المطلوب تحليل البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وقت جمع المقصود، سحب وDISCAطريق الأوراق واللحاء تجميد الإفرازات في السائل N 2 لاستخدامها مرة أخرى. اذا كانت هناك حاجة التخزين الموسعة، يجفد العينات وتخزينها في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة نبات الأرابيدوبسيس، يمكن بالفعل يتم الكشف عن نواتج الأيض بعد مجموعة من الإفرازات لمدة 1 ساعة. ومع ذلك، وجمع ل5-8 ساعة من المستحسن إذا تم التخطيط تحليل مكونات أقل وفرة. للنباتات الكبيرة مثل بريلا، ينصح مرات جمع أطول (8 ساعات). الافرازات التي تم جمعها من 15 ورقة هو عادة ما يكفي لحارة واحدة على SDS-PAGE هلام (البروتينات)، لاستخراج مرنا، GC-MS (السكريات ونواتج الأيض). لتحليل الدهون ويوصى تجميع عينات 2-3 (30-45 ينضح يترك) ويؤدي إلى نتائج أكثر وضوحا. </li></ol> 4. التحليل اللاحق (للحصول على الفيديو نظهر فقط 4.4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل البروتين، عينة resuspend في 15 ميكرولتر المياه و 30 ميكرولتر العازلة Lämmli والحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتدور بسرعة إلى أسفل أي عrecipitates وتحميل عينة كامل الصعود إلى SDS-PAGE هلام (45 جيوب التحميل ميكرولتر). يجب أن تكون ملطخة العينات مع Coomassie صمغي أو البقع الحساسة الأخرى منذ فرة البروتين منخفض جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة للسكر وتحليل المستقلب صغيرة، إضافة derivatizing كلاء لالعينة المجففة كما هو موضح في الأدب 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرنا يمكن تحليلها باستخدام RT-PCR، ميكروأري أو تحليل الحمض النووي الريبي تسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل الدهون على الفور تجمع 2-3 العينات وقسم ضد الكلوروفورم: ميثانول (1:1) في غطاء الدخان كما يلي: إضافة مبلغ مساو من الكلوروفورم: ميثانول إلى كل عينة، دوامة لمدة بضع ثوان، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 400 ز س. جمع (العضوية) مرحلة القاع في أنبوب زجاجي مع غطاء تفلون وتكرار التقسيم مع مرحلة أعلى ثلاث مرات أكثر. تجفيف المراحل العضوية المشتركة تحت تيار من N 2 وتقدم إلى مزيد من التحليل (طبقة رقيقة اللوني: TLC 14، 37؛ السائل اللوني الكتلة الطيفي: LC-MS 14). </li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

جمع EDTA-سهلت من اللحاء الإفرازات بسيطة جدا، ويحتاج الحد الأدنى من المعدات، وينطبق على معظم النباتات. وعموما، هذا الأسلوب يمتد القدرة على تحليل الإفرازات اللحاء من أكثر الأنواع. على الرغم من أن الافرازات غير المخفف، فمن السهل أن جمع العديد من عينات مختلفة أو من العديد من النباتات لزيادة لكمية كبيرة من المواد. هذا ثم يسمح للكشف عن المركبات الرواية التي هي في وفرة منخفضة جدا وولاها يمكن تجاهلها. هذه الطريقة يمكن استخدامها لأنواع النباتات متعددة ويعمل كما هو موضح لتلك المذكورة في هذه المخطوطة. إذا يتم استكشاف أنواع جديدة، واثنين من الجوانب التي قد تحتاج إلى تعديل هي عدد الأوراق المستخدمة والوقت من نضح. في معظم الحالات، ينبغي أن يكون نضح 5-8 ساعة مناسبة. للتأكد من استخدام هذه الطريقة للحصول على الأنواع النباتية الجديدة، الافرازات يحتاج إلى جمع واحد أو أكثر من تحليل لاحقة كما هو موضح في البروتوكول جزء 4 نeeds التي يتعين القيام بها. اعتمادا على شدة إشارة لوحظ، قد تحتاج إلى جمع حجم زيادتها. بشكل عام، سوف الدهون والبروتين تحليل تتطلب المزيد من المواد من السكر والأيض تحليل منذ السابق هي أقل وفرة في الإفرازات اللحاء. لأن جمع الافرازات EDTA-سهلت ينطوي على السطوح قطع فضلا عن تأثير المدمر المحتمل لEDTA، عدة نقاط يجب النظر فيها: (1) بعد الحضانة ساعة واحدة مع EDTA، وأعناق يجب غسلها جيدا. هذا يزيل أي المركبات التي تم الحصول عليها من خلايا الجرحى فضلا عن EDTA نفسها، والتي يمكن أن تضر خلايا أو تتداخل مع الاستخراج. (2) بحاجة الضوابط الإيجابية والسلبية التي ستدرج لضمان وتستمد البيانات التي تم الحصول عليها من اللحاء SAP وليس من خلايا المصاب (انظر الخطوات الحاسمة أدناه). (3) اللحاء SAP لا تحتوي على العديد من الإنزيمات، والتي يمكن أن تكون نشطة خلال جمع الافرازات. وبالتالي، في بعض الحالات، قد يكون من المفيد جمع FOR كميات مختلفة من الوقت. (4) منذ الأسلوب تشارك نضح في الماء، وهو الكمي المطلق من المركبات غير ممكن. الخطوات الحاسمة: إن مفتاح نجاح استخدام هذا الأسلوب هو استخدام الحذر أثناء التعامل مع العينة أن لا تجرح أي الخلايا وكذلك استخدام الضوابط المناسبة (انظر المرجع 14). واحد للتحكم مناسبة هو مجموعة من الإفرازات اللحاء دون معالجة مسبقة مع EDTA. في هذه الحالة سوف اللحاء عزل نفسه ويمكن جمع أي الافرازات. سوف يتم الكشف عن أي تلويث المركبات القادمة من خلايا الجرحى هنا. ومن شأن التحكم الثاني يكون تحليل السكريات في الافرازات. في نبات الأرابيدوبسيس، ينبغي أن يكون السكروز السائد الأيض داخل اللحاء SAP، مع الفركتوز إلى نسبة السكروز من 1:04 حتي 01:08 (المرجع 8، 14). لاستخراج الحمض النووي الريبي استخدام مثبط ريبونوكلياز هو ضروري. وبالإضافة إلى ذلك، تحكم إيجابية من describ سابقاإد مرنا اللحاء المترجمة (UBC9: اليوبيكويتين انزيم التصريف 9، At4g27960، 8، 14) والسيطرة السلبية من على سبيل المثال مرنا بلاستيدات الخضراء (Rubisco LSU) هي الأفضل. لأن الافرازات تحتوي على خمائر نشطة، وينصح دورة الوقت لإجراء تغييرات في التشكيل الجانبي متأكد من اللحاء ليست ببساطة بسبب الاختلافات في وقت جمع. في بعض الحالات، قد يكون من المفيد استخدام مثبطات بروتين. ومع ذلك، فإن المحققين بحاجة إلى أن نضع في اعتبارنا، أن الافرازات التي تم جمعها سوف تتركز والتي سوف تتركز إلى حد كبير أي مركبات المضافة. والخطوة الثانية الحاسمة ضمن البروتوكول هو recutting من سويقات تحت EDTA. هذه الخطوة تخدم غرضا مزدوجا: أولا، أنه يزيل أي لوحات غربال مختومة في حين منع تشكيل جديد المقابس وبالتالي السماح للتدفق الحر للاللحاء SAP. الثاني، فإنه يزيل فقاعة التجويف في الخشب ولدت في حين خفض وبالتالي يسمح للنقل الخشب. حجم الخفض الثاني تعتمدق على النباتات المستخدمة. في النباتات مع أعناق أكبر ينبغي أن يكون عدة مليمترات (ما يصل إلى 1 سم) فوق قطع الأول، في النباتات مثل نبات الأرابيدوبسيس، مم 1-2 تكفي. ويمكن استخدام هذه الطريقة تؤدي إلى اكتشاف مركبات جديدة في الإفرازات اللحاء التي كان يمكن أن يشير، والآثار التنموية أو الطب الحيوي. وقد دفع ذلك أكثر نظرة متعمقة في إشارة الدهون لمسافات طويلة، والذي كان حقل القليل المدروسة ضمن علوم النبات ويرجع ذلك إلى عدم الوصول إلى اللحاء.

النباتات لا يمكن أن تتحرك إلى الفرار من الظروف المعاكسة. ونتيجة لذلك، كان لديهم لتطوير آليات للكشف عن الضغوط البيئية، وانتزاع إرسال إشارة ذات الصلة في جميع أنحاء المصنع، وضبط التنمية وفقا لذلك. توجد نظم النقل اثنين لتوزيع المياه والمواد الغذائية وغيرها من المركبات (إشارات). الأول هو الخشب؛ الذي ينقل عادة الماء والمعادن تناولها من قبل الجذور في جميع أنحاء المصنع. والثاني هو اللحاء. لقد تغيرت وجهة نظر اللحاء من استيعاب نظام النقل بسيطة لقناة لRNA والبروتين، والفيروسات، والدهون والجزيئات الصغيرة الأخرى. انها تلعب دورا هاما في استيعاب ونقل المواد الغذائية، استجابة للضغوط الحيوية وغير الحيوية، وكذلك في نمو وتطور النبات. ويطلق الآن عليها اسم &quot;طريق المعلومات السريع&quot; من النبات 18. ويتكون اللحاء من عدة أنواع من الخلايا: لحمة اللحاء، وكذلك رفيق المتخصصة CELLS وعناصر غربال. العنصر غربال هو موقع الحركة لمسافات طويلة. للسماح لتدفق طولية دون عائق، وعناصر غربال مفقودة معظم العضيات وكذلك النوى والتي يعتقد أنها تحتوي في أحسن الأحوال محدودة الآلات متعدية 21، 33. ويعتقد أن الخلايا رفيق تجميع البروتينات وغيرها من المركبات التي تسافر في تيار اللحاء. ثم يتم نقل هذه المركبات إلى عنصر غربال عبر رابطات هيولية ويمكن أن تعمل كإشارات لمسافات طويلة 4،16. يمكن العثور على عدة مجموعات من المركبات في الإفرازات اللحاء: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السكريات وغالبا ما تكون المنتجات من التمثيل الضوئي ويتم نقلها على أنها &quot;تحمل الطاقة&quot; الجزيئات إلى أجزاء أخرى من النبات لتخزين أو لبنات البناء. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تعمل أيضا كمضاد للتجميد أو كما يشير المركبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا أن تكون موجودة في البروتينات الإفرازات اللحاء. وهي تشمل الإنزيمات الأيضية ولكن أيضا قد يشير إلى وظيفة. واحد أمثلجنيه من البروتين والتي هي بمثابة إشارة التنموية هي مزهرة موضع T البروتين، وهو ما يشير إلى تحريض المزهرة وكذلك اقتطاع ورقة الموسمية في النباتات. 6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأحماض النووية موجودة في الإفرازات اللحاء في شكل مرنا، الرناوات الصغيرة ومتناهية الصغر، والرنا الفيروسي. تظهر أن تشارك إلى حد كبير في إشارة 27، 28، 39. في نفس الوقت، وقد لوحظت الريباسي وtRNAs لجميع الأحماض الأمينية تقريبا في اللحاء SAP من القرعيات 42. تظهر على أن يتم تحويلها بشكل انتقائي في النظام أنبوب غربال. وtRNAs تظهر التعديلات الضرورية نظرا لقدرته على نقل الأحماض الأمينية إلى الجهاز متعدية. حتى الآن، بدلا من المشاركة في الترجمة، ويبدو أنها تمنع هذه العملية. بدلا من ذلك، فإنها يمكن أن تكون بمثابة مصدر سيتوكينين أو إشارة حالة التمثيل الغذائي للنبات 42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم العثور على الأحماض الدهنية، oxylipins، والدهون الأخرى أيضا في اللحاء الإفرازات 3، 13، 14، 23. JasmoNIC حامض، تتحرك oxylipin من خلال اللحاء كجزء من الاستجابة للعدوى الممرض 22، 29، 31، 32. في حين أن دور معظم الدهون اللحاء لا يزال غير واضح، وبعضها من المرجح أن يشير ظيفة 4. </li></ul> ويتمثل التحدي في العمل مع اللحاء النبات تكمن في قدرته على عزل نفسه عند اصابة. هناك أربعة أساليب رئيسية تستخدم لجمع الإفرازات اللحاء، ولكنها تعمل فقط في الأنواع حدد: 1) في القرعيات أنه من الممكن الحصول على كميات معقولة من اللحاء الافرازات من خلال تخفيضات للسويقات. بمجرد إزالة الانخفاض الأولي مع التلوث من الخلايا المصاب، فمن الممكن الحصول على كميات كبيرة من الذهب الخالص معقول اللحاء SAP 1، 15. ومع ذلك، مع زيادة وقت جمع، هذه الافرازات يثخن، مما يجعلها غير صالحة على نحو متزايد لنهج اللوني السائل (غير منشورة). المنشورات الأخيرة تشير إلى أن تبعا للأنواع، ويستمد هذا اللحاء SAP من eitheص حزمي (FP) أو extrafascicular اللحاء (EP) والتي، في حين أنها لا تحتوي على &quot;المحمول&quot; اللحاء SAP من العناصر غربال (FP)، بل هو أيضا عرضة للتلوث من أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك الخشب 40، 41 . 2) والنهج الثاني هو الحصول على اللحاء SAP من خلال تخفيضات الضحلة أو ثقوب في الساق أو سويقات. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح في الترمس 17، 25، 36 القرعيات، والكرنب napus 12. هنا التلوث من الخلايا المصاب هو الحد الأدنى والإفرازات نقية جدا. ومع ذلك، النباتات تحتاج إلى أن تكون صحية وجيدة تسقى منذ انها صعبة للغاية لثقب انتقائي فقط العناصر غربال. إذا رصدت سفن الخشب، ويوجه كل الافرازات في مجرى الخشب. هذا يجعل طريقة غير مناسبة للنباتات مع أعناق أو سيقان هشة للغاية أو lignified للغاية. 3) stylectomy المن المن يسمح لإدراج مرود بهم في عناصر غربالن إزالة أولا بأول مع ليزر. وناضح اللحاء SAP من خلال ما تبقى من مرود 2، 9، 10، 35، 38. من الناحية النظرية، أي النباتات التي يمكن أن تصاب المن يمكن استخدامها لهذا النهج. ومع ذلك، فإن معظم الدفيئة أو مديري غرفة نمو لا يعتمد استخدام الممرض. وبالإضافة إلى ذلك، المن إدخال العديد من البروتينات في اللحاء مع لعابهم 19، 33. وهذا يؤدي إلى إعادة برمجة النسخي محدودة 30 و لديه القدرة على تغيير التركيبة اللحاء 26. 4) وصف الأسلوب هنا هو نضح EDTA-سهلت من اللحاء SAP. هذا الأسلوب يستخدم EDTA لمنع تسرب من اللحاء 20. EDTA يخلب كا 2 + الأيونات التي ستشارك خلاف ذلك في العمليات التي ختم اللحاء. بينما EDTA يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا 30، وقد استخدمت عدة مجموعات هذا الأسلوب، ويلاحظ أي تأثير سلبي من تركيزات EDTA من 10 ملم إلى 20 ملم على التركيب الدقيق خلية أو على phloeم التحميل والنقل 5، 24. للحد من أي تأثير ضار وكذلك التدخل من EDTA مع اللوني وهلام الكهربائي، يتم نقل النباتات الى الماء بعد 1 ساعة، ويستخدم فقط في جزء لاحق من الافرازات 14. وهكذا، بدلا من نضح في EDTA، وexudated اللحاء في الماء (EDTA-سهلت نضح). بل هو مستقيم إلى الأمام، وانخفاض التكلفة، ومنخفضة التقنية طريقة لجمع الإفرازات اللحاء. الحصول على اللحاء SAP بهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لتحليل البروتينات والجزيئات الصغيرة، والدهون، والرنا واستخدمت بنجاح في العديد من النباتات. في حين قد تم تنفيذ كمية محدودة من التجارب في ذوات الفلقة 11، الأسلوب يبدو أن أكثر ملاءمة لdicots (بريلا 17، 20، نبات الأرابيدوبسيس 8، 13، 14، الحور 7). مجموعة من الإفرازات أن تحدث في بيئة رطبة لتجنب فقدان الإفرازات من خلال النتح. اعتمادا على النبات، الحضانة في EDTA ل1-2 ساعات هوكافية لمنع ختم العناصر اللحاء / غربال. ويمكن بعد ذلك تحدث جمع في الماء. وهذا له فائدة من منع التأثير السلبي EDTA لديه على بنية الخلية والاستقرار. كما أنه يزيل التدخل من EDTA مع طرق مثل HPLC أو SDS-الصفحة. ويرد عليه كما ينطبق على نبات الأرابيدوبسيس. للنباتات أكبر، الحضانة في EDTA والافرازات مجموعات لابد من زيادتها، ويتم تنفيذها في الأكواب بدلا من 1.7 في أنابيب رد فعل مل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">K2-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">ED2P-500G</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm)</td>
			<td>PYREX or Corning</td>
			<td></td>
			<td>Any clean, shallow dish will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>EMD</td>
			<td>CX1054-1</td>
			<td style="width:223px;">Only open containers in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:111px;">9070-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">53283-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">Sun Sri</td>
			<td style="width:111px;">13-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:152px;">Denville</td>
			<td style="width:111px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

اللحاء المصنع هو ضروري لنقل لمسافات طويلة من (الصور) تستوعب وكذلك من الإشارات نقل الإجهاد الحيوية أو غير الحيوية. أنه يحتوي على السكريات والأحماض الأمينية والبروتينات والحمض النووي الريبي، والدهون والأيض الأخرى. بينما هناك اهتمام كبير في فهم تركيبة ووظيفة اللحاء، ودور كثير من هذه الجزيئات، وبالتالي، أهميتها في تطوير المصنع والإجهاد استجابة لديه لم يتحدد بعد. واحد عائقا أمام تحليل اللحاء تكمن في حقيقة أن الأختام اللحاء نفسه على جرح. ونتيجة لذلك، فإن عدد النباتات التي يمكن الحصول عليها اللحاء SAP محدودة. أسلوب واحد الذي يسمح مجموعة من الإفرازات اللحاء من عدة أنواع النباتات دون معدات المضافة هي اللحاء جمع الافرازات EDTA التي يسهلها وصفها هنا. في حين أنه من السهل الاستخدام، وأنها لا تؤدي إلى جرح الخلايا والرعاية يجب أن يؤخذ لإزالة محتويات الخلايا التالفة. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الضوابط لإثبات نقاء الافرازاتضرورية. لأنها تحلب بدلا من التحصيل المباشر من اللحاء SAP (غير ممكن في كثير من الأنواع) يمكن أن يحدث الكمي النسبي فقط من محتوياته. وميزة هذا الأسلوب مقارنة مع الآخرين هو أنه يمكن استخدامها في العديد من الأنواع النباتية العشبية أو الخشبية (بريلا، نبات الأرابيدوبسيس، الحور، الخ) ويتطلب الحد الأدنى من المعدات والتدريب. أنه يؤدي إلى كميات كبيرة من الإفرازات معقولة التي يمكن استخدامها لتحليلها لاحقا من البروتينات، والسكريات، والدهون، والحمض النووي الريبي والفيروسات ونواتج الأيض. انها بسيطة بما فيه الكفاية أنه يمكن أن تستخدم في كل من البحث وكذلك في مختبر التدريس.

لقد أصبح واضحا خلال السنوات القليلة الماضية أن تعقد اللحاء SAP قد يكون الجواب على السؤال عن كيفية إرسال إشارات متفاوتة النباتات التنموية والإجهاد للاستجابة المثلى. باستخدام EDTA-سهلت اللحاء نضح قد توفر فرصة لتحليل الإفرازات اللحاء من النباتات التي ليست مناسبة للمناهج أخرى ولكن قد يكون من مصلحة اقتصادية أو الفسيولوجية. هذا الأسلوب يسمح للحصاد ما يكفي من اللحاء الإفرازات لتحديد البروتينات اللحاء المترجمة وكشف عن تغيرات في مستوياتها استجابة لتطوير أو الإجهاد (الشكل 3). كما يظهر في الشكل، هي في وفرة البروتينات منخفضة جدا، وحتى الآن، ومستوى مرتفع بما يكفي لتجارب لاحقة باستخدام البروتينات LC-MS/MS أو تحليل لطخة غربية. النتائج في القرعيات تشير إلى أن قطع من جذع يؤدي إلى اختلال التوازن إمكانات المياه وتدفق المياه واللاحقةالملوثات المحتملة من apoplast 41. بعد جمع لمرات تتراوح 1-8 ساعات لا يؤثر على البروتين الشخصي اللحاء / تكوين في نبات الأرابيدوبسيس (. فقط المبلغ المطلق يختلف Guelette وآخرون)، وكمية البروتين التي تم جمعها وهذا النمط من البروتينات الموجودة تختلف بين الأنواع (نبات الأرابيدوبسيس: في؛ بريلا، لين أنا وNI) والعلاجات (بريلا نمت في أطوال مختلفة اليوم، لين أنا وNI). ونتيجة لذلك الإشارات البروتينية يمكن تصور، التي تم تحديدها، واتباعها. ويمكن أيضا أن تحدد مرنا ومتناهية الصغر الرنا في الإفرازات اللحاء بواسطة هذه الطريقة. ومع ذلك، مع العلاج ريبونوكلياز المانع ضروري لمنع تدهور مرنا خلال الفترة الممتدة نضح. منذ العناصر غربال لا تحتوي على البلاستيدات الخضراء وظيفية، Rubisco صغيرة أو كبيرة الوحيدات (كرات الدم الحمراء أو RbcL، على التوالي) mRNAs ويمكن استخدام ضوابط السلبية، في حين أن المعروف اللحاءالمترجمة مرنا مثل انزيم اليوبيكويتين-التصريف يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية (الشكل 4). وبالمثل، السكريات او نواتج صغيرة يمكن تحليلها باستخدام GC-MS أو LC-MS. وهنا تجدر الإشارة إلى أن الإفرازات اللحاء تحتوي على عدد كبير من الانزيمات وظيفية، بما في ذلك ما يقرب من مسار حال السكر كامل 12. وبالتالي، وذلك باستخدام العديد من النقاط الزمنية قد تكشف عن عمليات التمثيل الغذائي خلال جمع الافرازات. ويرد مثال في الشكل (5): في جميع الإفرازات، والسكروز هو المستقلب الأكثر وفرة، وهذا هو الأكثر وضوحا بعد جمع لمدة 1 ساعة. ومع ذلك، بعد خمس ساعات وانخفاض طفيف في نسبة السكروز إلى سكر الفواكه. إذا تم جمعها نفس الافرازات لمدة ساعة واحدة وترك على مقاعد البدلاء لساعات الأربع المقبلة، يتم تقليل السكروز إلى الفركتوز نسبة إلى حد أكبر من ذلك بكثير، مما يدل على أن الانزيمات النشطة في اللحاء الإفرازات تؤدي إلى تدهور السكروز في غرفة TEMاحلرارة (لمزيد من التفسيرات الذروة انظر 14). وهذا يتفق مع النتائج التي اللحاء التحميل والنقل من الجزيئات من الخلايا رفيق في عناصر غربال قد يستمر خلال نضح حتى يفقد النظام حيويتها 34. نسبة الدهون في الإفرازات اللحاء، وبالتبعية، مما يشير إلى الدهون لمسافات طويلة هي مجال حديث نسبيا من الاهتمام في علوم النبات. ونظرا لنسبة الدهون في طبيعتها مسعور موجودة فقط في تركيزات منخفضة، وربما يكون منضما إلى جزيئات أخرى لالانحلالية. ومع ذلك، فإن نضح EDTA-سهلت يسمح لجمع مادة كافية لتصور (TLC؛ الشكل 6) وتحديد (LC-MS؛ الشكل 7) نسبة الدهون في اللحاء من العديد من الأنواع النباتية. كما يظهر في الشكل فمن الممكن لتحديد وفصل العديد من الأنواع الدهنية. LC-MS يسمح لتحديد الأنواع المختلفة الدهون ورصد التغيرات في ملامح من المادة الدهنية من احالمورثات NT أو العلاجات. وهذا يسمح لدراسة دور الدهون خلال تطوير المصنع والاستجابة للضغط النفسي. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> الشكل 1. مخطط تدفق من مجموعة من الإفرازات اللحاء من نبات الأرابيدوبسيس أو بريلا. مسارات مختلفة تؤدي إلى منتجات نهائية مختلفة، والتي أشارت في الزرقاء. لإعداد الحمض النووي الريبي، ريبونوكلياز المانع (100 U / مل، روش) يضاف إلى الماء الذي يتم جمع الافرازات اللحاء. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> الشكل 2. إعداد المواد اللازمة لجمع اللحاء الافرازاتأيون. يعرض إعداد جميع المواد اللازمة لخطوات بروتوكول 3،1-3،4. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> الشكل 3 البروتينات الموجودة في اللحاء الإفرازات اثنين من الأنواع المختلفة النبات، نبات الأرابيدوبسيس (في) وبريلا (أنا وNI؛ أطوال اليوم مختلفة)؛ MW: الجزيئية علامة الوزن (حارة 2). تم فصل البروتينات باستخدام التدرج 10-20٪ SDS-PAGE. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> الشكل 4. تحليلوجود مرنا لRubisco الصغيرة والكبيرة الوحيدات (كرات الدم الحمراء وRbcL، على التوالي) وانزيم اليوبيكويتين-التصريف (UBC). وقد تم جمع مرنا من أوراق نبات الأرابيدوبسيس (L)، أعناق (P)، والإفرازات اللحاء (PH)، عكس النصوص المحولة ومحددة تصور باستخدام PCR. تم تعديل الرقم من Guelette وآخرون 14. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> الشكل (5). الشخصي GC-MS من اللحاء الإفرازات التي تم جمعها لكمية مختلفة من الأوقات. لاحظ كيف أن الكمية النسبية للتغيرات السكروز من المجموعة رقم 1 ساعة (A) إلى 5 ساعات من وقت جمع (B). الافرازات الشخصي بعد جمع لمدة 1 ساعة تليها &quot;الحضانة&quot; في غرفة<html> درجة الحرارة (RT) لمدة أربع ساعات (C). أوراق الملف الشخصي الأيض (D). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل (6)" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> الشكل (6). طبقة رقيقة اللوني مقارنة الدهون من بريلا (يسار) ونبات الأرابيدوبسيس أوراق (يمين) والإفرازات اللحاء. العلامات النجمية تشير الدهون محددة لالإفرازات اللحاء. DGDG: digalactosyldiacylglycerol؛ PG: phosphatidylglycerol؛ MGDG: monogalactosyldiacyglycerol، وجزء من شخصية عرض الدهون نبات الأرابيدوبسيس تم تعديل من Guelette وآخرون 14. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . NT &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> الرقم 7. صورة دهن من الإفرازات اللحاء من نبات الأرابيدوبسيس (كلوروفورم المرحلة) باستخدام LC-MS / وضع الأيونات السالبة. الرسوم البيانية في الجزء العلوي (متحولة، A) وأسفل (من النوع البري، B) تظهر الاختلافات في ملامح من المادة الدهنية بين اثنين من المورثات مختلفة (يشار إليه السهام). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method at JoVE.com

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

المعرفة من تكوين اللحاء SAP فضلا عن آلية التحميل والنقل لمسافات طويلة لها أمر ضروري لفهم الإشارات لمسافات طويلة في تطوير المصنع والإجهاد / استجابة الممرض واستيعاب وسائل النقل. يصف هذا المخطوط جمع الإفرازات اللحاء باستخدام طريقة EDTA-يسر.

جمع وتحليل<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; اللحاء الإفرازات باستخدام أسلوب EDTA-سهلت

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

collection-analysis-arabidopsis-phloem-exudates-using-edta

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

SCIENTISTS IN ACTION

24.3K Views.  Michigan State Universtiy.  المعرفة من تكوين اللحاء SAP فضلا عن آلية التحميل والنقل لمسافات طويلة لها أمر ضروري لفهم الإشارات لمسافات طويلة في تطوير المصنع والإجهاد / استجابة الممرض واستيعاب وسائل النقل. يصف هذا المخطوط جمع الإفرازات اللحاء باستخدام طريقة EDTA-يسر. 

Video: Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

جمع الدم لتحليل الكيمياء الحيوية في الزرد الكبار

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

تحليل خلية معينة من<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of Massachusetts (USA). Since then MTB have been discovered in stratified water- and sediment-columns from all over the world2. One feature common to all MTB is that they contain magnetosomes, which are intracellular, membrane-bound magnetic nanocrystals of magnetite (Fe3O4) and/or greigite (Fe3S4) or both3, 4. In the Northern hemisphere, MTB are typically attracted to the south end of a bar magnet, while in the Southern hemisphere they are usually attracted to the north end of a magnet3,5. This property can be exploited when trying to isolate MTB from environmental samples.
One of the most common ways to enrich MTB is to use a clear plastic container to collect sediment and water from a natural source, such as a freshwater pond. In the Northern hemisphere, the south end of a bar magnet is placed against the outside of the container just above the sediment at the sediment-water interface. After some time, the bacteria can be removed from the inside of the container near the magnet with a pipette and then enriched further by using a capillary racetrack6 and a magnet. Once enriched, the bacteria can be placed on a microscope slide using a hanging drop method and observed in a light microscope or deposited onto a copper grid and observed using transmission electron microscopy (TEM).
Using this method, isolated MTB may be studied microscopically to determine characteristics such as swimming behavior, type and number of flagella, cell morphology of the cells, shape of the magnetic crystals, number of magnetosomes, number of magnetosome chains in each cell, composition of the nanomineral crystals, and presence of intracellular vacuoles.

We demonstrate a method to collect magnetotactic bacteria (MTB) that can be applied to natural waters. MTB can be isolated and enriched from sediment samples using a relatively simple setup that takes advantage of the bacteria's natural magnetism. Isolated MTB can then be examined in detail using both light and electron microscopy.

جمع وعزل والإثراء التي تحدث بصورة طبيعية بكتيريا Magnetotactic من البيئة

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس<em&gt; في الموقع</em&gt; استخدام أسلوب TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

طريقة موحدة للتعقيم الفائق من بذور نبات

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

تحليل "سلوك نمو" نبات التمويل في "نوعيات مختلفة من الضوء"

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

أسلوب متعدد الاستخدامات لتركيب نبات يترك لتصوير الوقت الفاصل بين إينترافيتال

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

جمع وتحليل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي

جمع الدم لتحليل الكيمياء الحيوية في الزرد الكبار

تحليل خلية معينة من

جمع وعزل والإثراء التي تحدث بصورة طبيعية بكتيريا Magnetotactic من البيئة

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس

طريقة موحدة للتعقيم الفائق من بذور نبات

تحليل "سلوك نمو" نبات التمويل في "نوعيات مختلفة من الضوء"

أسلوب متعدد الاستخدامات لتركيب نبات يترك لتصوير الوقت الفاصل بين إينترافيتال

اثنين من الطبقات طريقة ساندويتش الغشاء لمجموعة اللعاب Laodelphax striatellus