المؤلفان بالشكر إلى مؤسسة إليسون الطبية لدعمهم. ونود أيضا أن نشكر أعضاء المختبر آبي Dernburg للحصول على المساعدة مع استخدام wormsorter.

1. الحصول على الثقافة المتزامنة من النشء الحيوانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الديدان على عدة لوحات NGM المصنف مع OP50-1 E. البكتيريا القولونية (10X تتركز من ثقافة مشبعة) حتى وصلت إلى العديد من الديدان مرحلة حامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الحيوانات مع الحل حامل البيض الإعدادية للحصول على الثقافة متزامنة (البيض). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البيض وحة على عدة 60 ملم لوحات NGM المصنف مع 10x المركزة OP50-1 في كثافة حوالي 150-200 بيضة / لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 25 درجة مئوية لمدة 2 يوم (حتى وصلت الديدان إلى L4 - يونغ مرحلة الكبار). </li></ol> 2. إعداد الزائفة الزنجارية لوحات واصابة الديدان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من البيض الإعدادية (الخطوة 1.1) تطعيم ثقافة PA14 :: GFP في 2 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على B ريفامبيسين الملك في تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية مع الإثارة O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة للPA14 :: GFP طريق مسدودتلح على العديد من لوحات القتل البطيء (SKP) حسب الحاجة للمقايسة. على كل 150 ملم SKP طبق بتري ماصة 75-100 ميكرولتر الثقافة المشبعة وموزعة بالتساوي باستخدام رش زجاجية معقمة. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 20-24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات من الحاضنة، والسماح لهم لتبرد لRT (~ 20 دقيقة). باستخدام العازلة M9، وغسل الديدان من الخطوة 1.4 على PA14 :: لوحات GFP في حجم الحد الأدنى من السائل. عند استخدام 150 مم لوحات، وعدة مئات من الديدان يمكن وضعها على لوحة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات عند 25 درجة مئوية لمدة 18-21 ساعة. لP. الزنجارية تتعرض الديدان الشباب البالغين، وهذا هو الوقت نافذة عرض التوزيع الأمثل للالمستعمرة ضد الحيوانات noncolonized. </li></ol> 3. إعداد Wormsorter قبل تنفيذ نموذج هذا النوع، تأكد من أن الجهاز يعمل بشكل صحيح. ويمكن الحصول على التفاصيل في http://www.unionbio.com/support/documents.aspx؟id=43، وعشروترد أدناه البريد الخطوات الأساسية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين ضغط صمام غمد إلى حوالي 5 رطل (4.5-5.5 المدى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من أن السائل غمد معدل التدفق المناسب، ووضع أنبوب 15 مل المخروطية تحت موزع، بدوره على صمام غمد، وإيقاف صمام فارز. عقد أنبوب تحت موزع لمدة 60 ثانية. يجب أن تكون وحدة التخزين في أنبوب مل 9-10. إذا كان خارج هذا النطاق، وضبط ضغط صمام غمد وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان أن السائل سوف غمد معدل التدفق (مجموعة كما في الخطوة 3.2) تسمح الفرز دقيقة، واختبار معدل الفرز باستخدام الجسيمات 40 ميكرون التحكم: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف صمام غمد. إضافة حوالي 25 مل من السيطرة حل الجسيمات إلى الخزان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على صمام غمد، وصمام العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على برامج الكمبيوتر، انتقل إلى &quot;مراقبة الوضع الجسيمات&quot; وانقر عليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن معدل تدفق الجسيمات هي جسيمات ~ 5-8 / ثانية، مع TOF (وقت الرحلة) تقارب العرضللجسيمات، 40 ميكرومتر. مثل هذا TOF يشير إلى أن واحدة 40 ميكرون الكائن فقط يمر في كل مرة. إذا كانت القيم هي خارج هذا النطاق، وضبط الإعدادات (بعد توجيهات أعلاه) وفقا لذلك. </li></ol> 4. الفرز المستعمرة مقابل Noncolonized الديدان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام M9، وغسل الديدان في أنابيب مخروطية 15 مل. تسمح الديدان البالغة لتنزل الى قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية وإزالة طاف. ملء الأنبوب مع M9 الطازجة. كرر هذه العملية 3-4X. هذا يزيل نسبة كبيرة من اليرقات وكذلك البكتيريا الزائدة ويستغرق حوالي 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الديدان إلى الخزان wormsorter مع بقضيب صغير خلط بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط كسب إشارة أولية عن طريق تعيين PMT الأخضر إلى 600 والأحمر والأصفر PMT إلى 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ستبدأ بالحصول على بيانات لضبط الإعدادات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهدف لمعدل النوع من الأحداث 25-30 (الديدان) في الثانية. إذا كان معدل عدد مرتفع جدا، ويخفف من الديدان في الخزان مع M9 وفقا لذلك. إذا كان معدل هوس منخفضة، وإضافة المزيد من الديدان في حجم صغير من M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت التجربة يتطلب فصل صارمة للغاية من المستعمرة ضد الديدان noncolonized، تعيين &quot;الاختيار صدفة&quot; إلى &quot;نقية&quot;. وهذا يضمن أنه في حال حدوث كائنين قريبة جدا من بعضها البعض أو في نفس قطرة، وآلة ترفض الانخفاض بدلا من جمع مثل هذه المعلومات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفرز السكان من الاهتمام، ووضع البوابات حول محاور مشيرا إلى حجم (للحصول على الديدان البالغة) وكثافة مضان (أي ارتفاع للاستعمار، وانخفاض لnoncolonized). يجب تحديد قيم مضان النابضة تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة متعددة جيدا أو طبق بتري تحت موزع لجمع الديدان ثم فتح صمام نوع لبدء الفرز الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع عدد صغير من السكان من الحيوانات للتحقق تحت المجهر أن عدد السكان هو فرز السكان من الاهتمام. إن لم يكن، وضبط المعلمات النابضة وفقا لذلك والاستمرار في جمع العينات. </li></ol>

<ol>
	<li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+analysis,+sorting,+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system.">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).</li><li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+analysis+of+in+vivo+spatiotemporal+promoteractivity+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).</li><li>Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Automated+High-throughput+Genome-wide+RNAi+Screens+in+elegans.">Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li><li>Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+for+mutants+affecting+dopaminergic-neuron+specification+in+C.+elegans.">Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans.</a> Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+recognition:+mechanisms+and+pathways.">Innate immune recognition: mechanisms and pathways.</a> Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).</li><li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance,+danger,+and+the+extended+family.">Tolerance, danger, and the extended family.</a> Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).</li><li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopyrin+activates+the+inflammasome+in+response+to+toxins+and+ATP.">Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP.</a> Nature. 440, 228-232 (2006).</li><li>Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+conserved+C.+elegans+genes+engages+pathogen-+and+xenobiotic-associated+defenses.">Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses.</a> Cell. 149, 452-466 (2012).</li><li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li><li>Tenor, J. L., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+Toll-like+receptor+is+required+for+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse+genetic+analysis+of+components+of+the+Toll+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans.">A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).</li><li>McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+translational+inhibition+by+Pseudomonas+aeruginosa+Exotoxin+A+Triggers+an+immune+response+in+Caenorhabditis+elegans.">Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).</li><li>Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+detects+pathogen-induced+translational+inhibition+to+activate+immune+signaling.">C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling.</a> Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).</li><li>Irazoqui, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+pathogenesis+and+host+responses+during+infection+of+C.+elegans+by+P.+aeruginosa+and+S.+aureus.">Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus.</a> PLoS Pathog. 6, (2010).</li><li>Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+infection+of+Caenorhabditis+elegans+induces+antifungal+immune+defenses.">Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses.</a> PLoS Pathog. , (2011).</li><li>Shapira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+a+GATA+transcription+factor+in+regulating+epithelial+innate+immune+responses.">A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).</li><li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans.">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. , 183 (2006).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+immune+responses+from+pathogen+colonization+supports+pattern+recognition+in+C.+elegans.">Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans.</a> PLoS One. , 7 (2012).</li><li>Jakobsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alkaloid+compound+harmane+increases+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans+during+bacterial+infection,+by+modulating+the+nematode's+innate+immune+response.">The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiol. 12, 49 (2012).</li><li>Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).</li><li>Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans.">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

طريقة وصفنا يستفيد من وضع العلامات الفلورية الكيانات خارج دودة، لمتابعة التفاعلات بين دودة وبيئته. في حالة نقدم، واستند على الفصل وسم الممرض وكان يعمل لالديدان منفصلة مع الممرض الحمل الثقيل من تلك مع عدم وجود (أو الضوء) حمولة. العثور على لاحقة تحليل التعبير الجيني لا...

التلقائي الفرز الدودة يشبه إلى حد كبير نظام مراقبة الأصول الميدانية، وتعمل من خلال قياس إشارة الفلورسنت في دودة (شريطة عادة عن طريق التعبير المعدلة وراثيا من البروتينات مراسل) لأنها تمر في أنبوب تقويمها، مما يتيح إعادة توجيه إما إلى أنبوب جمع / جيد أو إلى حاوية النفايات وفقا لالنابضة المعلمات التي وضعتها الباحثة 1. وwormsorter يمكن أن تسهل البحث في نواح كثيرة؛ مثال على توظيفها كأداة تحليلية هو دراسة أنماط الزمانية المكانية التي تلت النشاط المروج لما يقرب من 1،000 الجينات 2. ومع ذلك، فإن الاستخدام الرئيسي للwormsorter في شاشات الجينية، وبعد الهدف مستويات التعبير الجيني أو توطين بروتين فلوري على طول محور الدودة 3-5. هنا، نحن تصف تطبيق جديد لwormsorter، في أعقاب الاستعمار من دودة من قبل الممرض الموسومة fluorescently. مع هذا كأداة ركزنا على العلاقة بين pathogأون الاستعمار / تحميل والاستجابة المناعية، للحصول على أفكار جديدة في الآليات المسؤولة عن الشروع في الاستجابات المناعية في دودة. في جميع الكائنات الحية تقريبا درست حتى الآن، الشروع في الاستجابات المناعية الفطرية لمسببات الأمراض الميكروبية يتوقف على الاعتراف أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض (PAMPs)، و / أو الخطر / الضرر المرتبط أنماط الجزيئية (DAMPs) 6،7. وتشمل الثانية، وكلاهما صدر الجزيئات (مثل ATP 8)، والبروتينات تغييرها أو علامات أخرى من العمليات الخلوية تغير 9،10؛ الهياكل الميكروبية يتم حفظها الأولى التي تشمل مكونات جدار الخلية الجرثومية، سوط منها، أو طبقة ثنائية الدهن 6 منه. يتم التعرف على كلا النوعين من الإشارات من البروتينات تسمى مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير)، التي تقوم عليها محددة وملزمة من جزيء نمط تفعيل سلسلة من الأحداث التي أدت إلى استجابة واقية. C. وقد ايليجانس مفيدة للغاية باعتبارها tractaنموذج بلي لتشريح مختلف جوانب التفاعلات المضيف الممرض، ولكن الشيء الوحيد الذي لا يمكن فهمه جيدا هو كيف يتم البدء الاستجابات المناعية في دودة. وقد تبين أن أيا من المستقبلات المفترضة التي هي orthologous لمستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) في الكائنات الحية الأخرى لربط PAMPs، والعديد من orthologs من خنازير أن تقوم بدور محوري لالاستجابات المناعية في الكائنات الحية الأخرى تظهر مساهمة محدودة من المستغرب أن الاستجابات دودة الممرض والمقاومة. على سبيل المثال، الرقم مستقبلات ذبابة الفاكهة، وهو أمر ضروري لمقاومة مسببات الأمراض إيجابية الجرام، تتمثل في C. ايليجانس من قبل homolog الوحيد، تول-1، مما يسهم في الحماية من غرام سلبي السالمونيلا التيفية الفأرية الممرض 11، ولكن ليس من سلبية الغرام، ومسببات الأمراض أو إيجابية أخرى اختبار 11،12. هذه الملاحظات، جنبا إلى جنب مع بيانات تشير إلى أن الاستجابات المناعية يمكن أن يتسبب من خلال تعطيل البروتين الخلوي الترجمة حكما أدى بعض تشير إلى أن C. ايليجانس في المقام الأول بالكشف عن DAMPs 9،13،14. ومع ذلك، تشير التقارير التي تصف قدرة مسببات الأمراض القتلى للحث على الاستجابات المناعية التي PAMP ملزمة يجوز لها دور هام في التعرف على العوامل المسببة للأمراض في C. ايليجانس 15،16. العمل السابق مع التركيز على الاستجابات المناعية في سن متطابقة وراثيا متزامنة C. ايليجانس السكان، تظاهر تقلب فردية كبيرة في استعمار الامعاء من البكتيريا سلبية الغرام الممرض الزائفة الزنجارية. ومع ذلك، وتعامل دراسات النسخي هؤلاء السكان المستعمر بنسب مختلفة، واحدة كيان 17،18. الاستفادة من هذا التباين، وضعنا بروتوكولا مع التركيز على wormsorter الآلي لفصل السكان المستعمر بشكل مختلف من انواع معينة ايليجانس تتعرض ل، معربا عن GFP P. الزنجارية. دراسة التعبير الجيني في السكان المستعمر بشكل مختلف، القوات الجويةتقييم litated للعلاقة بين الحمل الممرض (والأضرار المرتبطة بها) والاستجابات المناعية، وقدمت رؤى جديدة حول التعرف على العوامل المسببة للأمراض في C. ايليجانس 19. أدناه ونحن تصف البروتوكول، والتي يمكن تطبيقها لفرز المصابين الديدان الممرض أي fluorescently المسمى. إلى المستخدمين المحتملين تجدر الإشارة إلى أن عدد الديدان المطلوب تسويتها يعتمد على طبيعة التحليلات والبروتوكولات اللاحقة في الاستخدام. على سبيل المثال، في حالة تحليل ميكروأري التعبير الجيني،&gt; سيطلب 1،000 الديدان للحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي، إذا تم استخدام البروتوكولات القياسية، ولكن ~ 100 الديدان يكفي إذا استخدمت التضخيم، مما يسمح بسرعة جمع المواد وبالتالي تقليل الإجهاد ل الديدان.

<table><tbody><tr><td>M9 Buffer</td><td>prepared in house</td><td></td><td>Recipe at wormbook.org</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Egg prep solution</td><td>prepared in house</td><td></td><td>50 ml water; 40 ml bleach; 10 ml of 10 N sodium hydroxide</td></tr><tr><td>NGM plates</td><td>prepared in house</td><td></td><td>Recipe at wormbook.org</td></tr><tr><td>SKP plates</td><td>prepared in house</td><td></td><td>Recipe same as NGM only 0.35% peptone instead of 0.25%</td></tr><tr><td>Control test particles</td><td>Union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr></tbody></table>

automated separation of c. elegans variably colonized by a bacterial pathogen

وwormsorter أداة مماثلة لآلة نظام مراقبة الأصول الميدانية التي يتم استخدامها في دراسات ايليجانس انواع معينة، وعادة لفرز الديدان على أساس التعبير عن مراسل الفلورسنت. هنا، نسلط الضوء على استخدام بديل من هذا الصك، لفرز الديدان وفقا لدرجة الاستعمار من قبل الممرض، معربا عن GFP. يسمح لنا هذا الاستخدام الجديد لمعالجة العلاقة بين الاستعمار من الأمعاء دودة وتحريض الاستجابات المناعية. في حين C. وقد تم توثيق ايليجانس الاستجابات المناعية لمسببات الأمراض المختلفة، فإنه لا يزال غير معروف ما يبدأ بها. الاحتمالات الرئيسيان (والتي لا يستبعد بعضها بعضا) هي الاعتراف أنماط الجزيئية المرتبطة الممرض، والكشف عن الأضرار الناجمة عن العدوى. التفريق بين الاحتمالين، يجب أن تنفصل التعرض لمسببات المرض من الأضرار التي يتسبب بها. لتمكين wormsorter فصل الديدان التي كانت مستعمرة على نطاق واسع من قبل الغرام نالممرض egative الزائفة الزنجارية، مع الضرر المحتمل الناجم عن الحمل الممرض، من الديدان التي تعرضت بالمثل، ولكن لا، أو هامشيا، المستعمر. واستخدمت هؤلاء السكان متميزة لتقييم العلاقة بين الممرض الحمل وتحريض الاستجابات المناعية النسخي. وتشير النتائج إلى أن اثنين وفصلها، ودعم إمكانية الاعتراف الممرض.

عندما يقابل عمر، متطابقة وراثيا C. ويتعرض ايليجانس إلى P. الزنجارية، ويلاحظ توزيع واسعة في مستويات الاستعمار (الشكل 1A). مع مساعدة من بروتوكول الموصوفة هنا فصل كفاءة noncolonized من الديدان المستعمر لا يمكن أن يتحقق (الشكل 1B). على عكس الديدان no...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen at JoVE.com

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

وwormsorter يسهل شاشات الوراثية في انواع معينة ايليجانس عن طريق الفرز الديدان وفقا لتعبير عن صحفيين الفلورسنت. هنا، نحن تصف استخدام جديدة: الفرز وفقا لاستعمار من قبل الممرض، معربا عن GFP، ونحن نوظف ذلك لدراسة دور غير مفهومة الاعتراف الممرض في الشروع في الاستجابات المناعية.

الفصل الآلي لل<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; المستعمرة بنسب مختلفة من قبل الممرض الجرثومي

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

automated-separation-c-elegans-variably-colonized-bacterial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

8.3K Views.  University of California, Berkeley.  وwormsorter يسهل شاشات الوراثية في انواع معينة ايليجانس عن طريق الفرز الديدان وفقا لتعبير عن صحفيين الفلورسنت. هنا، نحن تصف استخدام جديدة: الفرز وفقا لاستعمار من قبل الممرض، معربا عن GFP، ونحن نوظف ذلك لدراسة دور غير مفهومة الاعتراف الممرض ?...

Video: Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

ايليجانس كاينورهابديتيس السلكية-نموذج تنوعاً في فيفو لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والمضيف

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Genetics

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic fungal pathogen of humans, is the fourth most common cause of nosocomial infections which results in ~40% mortality. However, other C. albicans infections are less severe and rarely lethal and include vulvovaginal candidiasis, impacting ~75% of women, as well as oropharyngeal candidiasis, predominantly impacting infants, AIDS patients and cancer patients. While murine models are most frequently used to study C. albicans pathogenesis, these models predominantly assess host survival and are costly, time consuming, and limited in replication. Therefore, several mini-model systems, including Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella, and Caenorhabditis elegans, have been developed to study C. albicans. These mini-models are well-suited for screening mutant libraries or diverse genetic backgrounds of C. albicans. Here we describe two approaches to study C. albicans infection using C. elegans. The first is a fecundity assay which measures host reproduction and monitors survival of individual hosts. The second is a lineage expansion assay which measures how C. albicans infection affects host population growth over multiple generations. Together, these assays provide a simple, cost-effective way to quickly assess C. albicans virulence.

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

Fungal opportunist pathogens can cause life-threatening as well as minor infections, but non-lethal phenotypes are frequently ignored when studying virulence. Therefore, we developed a nematode model that monitors both the survival and reproduction aspects of host to investigate fungal virulence.

While pathogens can be deadly to humans, many of them cause a range of infection types with non-lethal phenotypes. Candida albicans, an opportunistic ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

بروتوكول لتصيب<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; مع<em&gt; السالمونيلا التيفية الفأرية</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

الفائق، والمحتوى السامي، المستندة إلى سائل C. ايليجانس باثوسيستيم

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the context of the intestines. Recently, ecological sampling of wild Caenorhabditis nematodes has discovered a diverse array of associated microbes, including bacteria, viruses, fungi, and microsporidia. Many of these microbes have interesting colonization or infection phenotypes that warrant further study, but they are often unculturable. This protocol presents a method to enrich the desired intestinal microbes in C. elegans and related nematodes and reduce the presence of the many contaminating microbes adhering to the cuticle. This protocol involves forcing animals into the dauer stage of development and using a series of antibiotic and detergent washes to remove external contamination. As dauer animals have physiological changes that protect nematodes from harsh environmental conditions, any intestinal microbes will be protected from these conditions. But, for enrichment to work, the microbe of interest must be maintained when animals develop into dauers. When the animals leave the dauer stage, they are singly propagated into individual lines. F1 populations are then selected for desired microbes or infection phenotypes and against visible contamination. These methods will allow researchers to enrich unculturable microbes in the intestinal lumen, which make up part of the natural microbiome of C. elegans and intracellular intestinal pathogens. These microbes can then be studied for colonization or infection phenotypes and their effects on the host fitness.

Selective Cleaning of Wild Caenorhabditis Nematodes to Enrich for Intestinal Microbiome Bacteria

Wild Caenorhabditis nematodes are associated with many microbes, often in the gut lumen or infecting the intestine. This protocol details a method to enrich unculturable microbes colonizing the intestine, taking advantage of the resistance of the dauer cuticle.

التنظيف الانتقائي للنيماتودا Caenorhabditis البرية لإثراء لبكتيريا الميكروبيوم المعوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans)&#160;has proven to be an excellent model for studying host-microbe interactions and the microbiome, especially in the ...

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in their progeny and promote survival. While inherited immunity has been reported in many invertebrates, the mechanisms underlying this epigenetic phenomenon are largely unknown. The infection of Caenorhabditis elegans by the natural microsporidian pathogen Nematocida parisii results in the worms producing offspring that are robustly resistant to microsporidia. The present protocol describes the study of intergenerational immunity in the simple and genetically tractable N. parisii -C. elegans infection model. The current article describes methods for infecting C. elegans and generating immune-primed offspring. Methods are also given for assaying resistance to microsporidia infection by staining for microsporidia and visualizing infection by microscopy. In particular, inherited immunity prevents host cell invasion by microsporidia, and fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used to quantify invasion events. The relative amount of microsporidia spores produced in the immune-primed offspring can be quantified by staining the spores with a chitin-binding dye. To date, these methods have shed light on the kinetics and pathogen specificity of inherited immunity, as well as the molecular mechanisms underlying it. These techniques, alongside the extensive tools available for C. elegans research, will enable important discoveries in the field of inherited immunity.

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

The infection of Caenorhabditis elegans by the microsporidian parasite Nematocida parisii enables the worms to produce offspring that are highly resistant to the same pathogen. This is an example of inherited immunity, a poorly understood epigenetic phenomenon. The present protocol describes the study of inherited immunity in a genetically tractable worm&#160;model.

دراسة المناعة الموروثة في نموذج Caenorhabditis elegans لعدوى Microsporidia

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

RNA Fluorescence in situ Hybridization (FISH) to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as microsporidia and viruses. Because of the similarities between Caenorhabditis elegans and mammalian intestinal cells, as well as the power of the C. elegans system, this host has emerged as a model system to study host intestine-microbe interactions in vivo. While it is possible to observe some aspects of these interactions with bright-field microscopy, it is difficult to accurately classify microbes and characterize the extent of colonization or infection without more precise tools. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be used as a tool to identify and visualize microbes in nematodes from the wild or to experimentally characterize and quantify infection in nematodes infected with microbes in the lab. FISH probes, labeling the highly abundant small subunit ribosomal RNA, produce a bright signal for bacteria and microsporidian cells. Probes designed to target conserved regions of ribosomal RNA common to many species can detect a broad range of microbes, whereas targeting divergent regions of the ribosomal RNA is useful for narrower detection. Similarly, probes can be designed to label viral RNA. A protocol for RNA FISH staining with either paraformaldehyde (PFA) or acetone fixation is presented. PFA fixation is ideal for nematodes associated with bacteria, microsporidia, and viruses, whereas acetone fixation is necessary for the visualization of microsporida spores. Animals were first washed and fixed in paraformaldehyde or acetone. After fixation, FISH probes were incubated with samples to allow for the hybridization of probes to the desired target. The animals were again washed and then examined on microscope slides or using automated approaches. Overall, this FISH protocol enables detection, identification, and quantification of the microbes that inhabit the C. elegans intestine, including microbes for which there are no genetic tools available.

RNA Fluorescence in situ Hybridization FISH to Visualize Microbial Colonization and Infection in Caenorhabditis elegans Intestines

Intestinal microbes, including extracellular bacteria and intracellular pathogens like the Orsay virus and microsporidia (fungi), are often associated with wild Caenorhabditis nematodes. This article presents a protocol for detecting and quantifying microbes that colonize and/or infect C. elegans nematodes, and for measuring pathogen load after controlled infections in the lab.

التهجين الفلوري للحمض النووي الريبي في الموقع (FISH) لتصور الاستعمار الميكروبي والعدوى في أمعاء Caenorhabditis elegans

The intestines of wild Caenorhabditis nematodes are inhabited by a variety of microorganisms, including gut microbiome bacteria and pathogens, such as ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Biology

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

فحص عالي الإنتاجية للعزلات الميكروبية مع التأثير على صحة Caenorhabditis elegans

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

استخدام بيانات الدودة المفردة لقياس عدم التجانس في التفاعلات البكتيرية Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

الفصل الآلي لل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ايليجانس كاينورهابديتيس السلكية-نموذج تنوعاً في فيفو لدراسة التفاعلات بين الميكروبات والمضيف

Two Infection Assays to Study Non-Lethal Virulence Phenotypes in C. Albicans using C. Elegans

بروتوكول لتصيب

الفائق، والمحتوى السامي، المستندة إلى سائل C. ايليجانس باثوسيستيم

التنظيف الانتقائي للنيماتودا Caenorhabditis البرية لإثراء لبكتيريا الميكروبيوم المعوية

دراسة المناعة الموروثة في نموذج Caenorhabditis elegans لعدوى Microsporidia

التهجين الفلوري للحمض النووي الريبي في الموقع (FISH) لتصور الاستعمار الميكروبي والعدوى في أمعاء Caenorhabditis elegans

أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans

فحص عالي الإنتاجية للعزلات الميكروبية مع التأثير على صحة Caenorhabditis elegans

استخدام بيانات الدودة المفردة لقياس عدم التجانس في التفاعلات البكتيرية Caenorhabditis elegans