الكتاب أود أن أشكر الدكتور كانديس هسيه للحصول على اقتراحات والمساعدة مع تقنيات التصوير والدكتور وو دوريس لخبرة في التشريح فرخ الأذن الداخلية خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر. وأيد هذا العمل من قبل NSF-IOS 0642346، NIH-T32 DC010775، NIH-T32 GM008620، NIH-R01 DC010796، وDOE GAANN P200A120165.

1. إعداد أدوات تشريح التالية والكواشف <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF؛ 130 مم كلوريد الصوديوم، 3 مم بوكل، 1.2 ملي KH 2 PO 4 و 20 ملي NaHCO 3 و 3 HEPES مم، 10 مم الجلوكوز، 2 مم CaCl 2، 1،3 ملي MgSO 4) غرست باستمرار مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 في درجة حرارة الغرفة. للتسريب، وملء إلى 3/2 ألف 500 مل جرة Nalgene واسعة الفم مع وجود ثقب حفر في الغطاء. وسوف تعلق دبابات من أنابيب الزجاج إلى عوامات الجذعية، والتي تخترق ACSF من خلال ثقب في الغطاء جرة. ضبط ضغط للحصول على تيار مستمر من الفقاعات التي تصل إلى حوالي 1/3 من السائل ولكنها ليست قوية بما يكفي للتسبب الرش على الحافة. يغرق 5 قوارير الزجاج مل (إلى 6) في جرة Nalgene لفصل العينات الفردية عن بعضها البعض والغاز من الاضطراب التدفق. وينبغي المؤكسج ACSF مدة لا تقل عن 20 دقيقة قبل أي حضانة الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبق صغير تشريح سيليكون (35 × 10 مممم بيتري Sylgard المغلفة باستخدام Elastomere كيت) مع دبابيس تشريح 2 وضعها في البوليسترين سداسية صغيرة (47 مم أسفل) تزن القارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اثنين غرامة ملقط غيض، واحدة منحني ملقط غيض، دورق 50 مل، وحاوية للنفايات الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحبت الزجاج micropipette (1.2 OD / 0.9 ID) إلى حوالي 20-50 كسر ميكرومتر فتح في الطرف ومليئة رودامين ديكستران أمين (RDA، MW = 3،000، إينفيتروجن) في محلول 6.25٪ مع 0.4٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني . بواسطة أنابيب إرفاق غرامة لpicospritzer واستقرار لمياداة مجهرية. </li></ul> 2. الدقيقة لكشف تشريح الحليمة قاعدي في E8 4،5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملقط المنحني، وقطع E8 الجنين أقل بقليل من الدماغ، ووضع الرأس مباشرة على طبق تشريح سيليكون المغلفة داخل تزن القارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إمالة الرأس باستخدام دبابيس تشريح، ضع الرأس بهدف بطني حتى الأذن على جانب الفائدة مرئيا قليلا، قليلا وظهريا مشيرا 10-30 درجة بعيدا عن مnter (الشكل 2A). تأمين على الفور الرأس مع الدبابيس. إذا هو المطلوب الثنائية تتبع، رئيس مركز في 0 درجة، أو مرأى ومسمع بطني بحيث يمكن الوصول إليها كلا الجانبين. وبالمثل، لحقن في الجانب الأيسر من الرأس في تأمين -10 إلى -30 درجة من وسط الجانب الأيسر حتى يمكن الوصول إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الدورق 50 مل، 30 مل من نقل الاوكسيجين في ACSF الطبق، غمر تماما الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فهم بلطف وقشر أسفل الفك السفلي باستخدام ملقط غرامة تلميح، ثم إزالة الجفن السفلي على جانب الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنسجة الوعائية المغطي، بما في ذلك أي الحنك المتبقية والمريء. وينبغي لهذه الأنسجة الرخوة قشر بعيدا الكشف عن سطح أملس تطوير القحف الغضروفي مع الشرايين الفقري مميزة في سطحه. من هذه النقطة، يجب السمة الشامل otoconial بيضاء تكون مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح بعناية الجلد حول الصماخ الخارجي، غضروف مفصل الفك، وإلى الأذن الوسطى مع ترك فيالمجموع الأذن سليمة. استخدام ملقط لخفض بلطف بعيدا هذه الهياكل الغضروفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرايين الفقري وتجمع الدم باستخدام اقتراح لطيف واسعة مع ملقط غرامة نصائح. يمكن مشاهدة الدم والتخثر يحجب قد سد افتتاح ماصة الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القناة القوقعي مع ظهارة حسية المجاورة (القاعدي حليمة) والعقدة تكمن الصوتية مباشرة تحت القحف الغضروفي 6 و يمكن تصور باعتبارها الإسقاط الإصبع تشبه ممدود تمتد من الأذن الداخلية بطنيا، مع الطرف البعيد في أقصى (قمة) بالقرب من الأمامية خط الوسط 5. قد يكون هناك تجمع صغيرة من الدم (الحمراء) من تشريح و / أو تكلس الحصيات السمعية (أبيض) في ذروة القناة قوقعة الأذن (الشكل 2B) التي يمكن أن تساعد في التصور. يعتقد رقعة الحسية في ذروة هو البقعة lagenar، لتكون وظيفة الدهليزي 7،8. </li></ol> 3. انتقائية وصفها من ألياف CN السمعي VIII <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; ضع ماصة الحقن بالقرب من سطح الجنين في المنطقة قوقعة حليمة القناة والقاعدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض ببطء micropipette إلى ثقب الجمجمة لأول مرة. هذه المنطقة هي الجمجمة أرق من المناطق المحيطة بها، ويتطلب أقل قوة لاختراق. يجب أن تكون الآن micropipette داخل قناة القوقعية. اختياري: يمكن إجراء حقن صغيرة من صبغة تتبع هنا للمساعدة في وضع الرؤية وحليمة القاعدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون تغيير موضع micropipette، مواصلة خفض المخالفات فقط حتى الحدود العميق للقناة القوقعية (الشكل 1). إجراء الحقن هنا وتكرار في مناطق متعددة على طول الحليمة القاعدي (أرقام 2C، 2D)، باستثناء الطرف الأكثر القريبة حيث يقع الحوقلة الدهليزي. مع تعيين picospritzer بين 10-30 رطل، يتم إجراء الحقن عدة. حجم السائل صبغ حقن يختلف، ويعتمد على مدى لوضع العلامات المطلوبة. ينبغي لكل الحقن يؤدي إلى LA-صبغة الفلورسنتbeled بقعة تقريبا من 200 - 400 ميكرون قطر (الشكل 2D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبمجرد أن حقن اكتمال استخدام ملقط لعينة المسح الشامل فوق جذع الدماغ واستخدام ماصة نقل لوضع جزء الذيلية في جرة صغيرة داخل حاوية من ACSF باستمرار يجري perfused مع 95٪ O 2/5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل الجنين، والسماح 20-30 دقيقة لنقل الصبغة، اعتمادا على مسافة تتبع المركزية المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنسجة والاستعداد لباجتزاء النسيجية. في المثال الموضح هنا، يتم غمر الأنسجة في بارافورمالدهيد 4٪ (1X PBS في) بين عشية وضحاها، والسكروز٪ 30 (1X PBS في) بين عشية وضحاها. </li></ol> 4. Counterstaining وتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstaining مفيد للمساعدة في توجيه المراقب لموقع التشريحية وكذلك تحديد مناطق معينة من الفائدة. وملون مباين فعالة في هذا الإعداد هو immunolabeling خيط عصبي (الشكلان 1، 3B، 3E)، الذي L بقوةabels محاور عصبية ويسمح لترسيم مساحات محور عصبي في الجهاز العصبي المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم تنفيذ تحليل في جميع أنحاء المنطقة المسمى، إذ أن التوقعات يمكن أن تمتد عدة مئات من ميكرون أو أكثر على طول محور rostrocaudal. بعض الأمثلة على التحليلات الأساسية هي: استهداف معدلات الخطأ والتوقيت و / أو تغييرات في أنماط الاختلاف في الإسقاط. محاور عصبية RDA التي تحمل علامات يمكن رؤيتها في النظام العصبي الطرفي والمركزي مع ارتفاع القرار (أرقام 3A، 3D). </li></ol>

<ol>
	<li>Groves, A. K., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+sound+in+space:+the+regulation+of+inner+ear+patterning.">Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning.</a> Development. 139, 245-257 (2012).</li><li>Pflieger, J. F., Cabana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vestibular+primary+afferents+and+the+vestibulospinal+projections+in+the+developing+and+adult+opossum,+Monodelphis+domestica.">The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica.</a> Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).</li><li>Molea, D., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+topography+of+nucleus+magnocellularis+innervation+by+the+cochlear+ganglion.">Timing and topography of nucleus magnocellularis innervation by the cochlear ganglion.</a> The Journal of Comparative Neurology. 466, 577-591 (2003).</li><li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken.">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of Comparative Neurology. 368, 620-630 (1996).</li><li>Brigande, J. V., Kiernan, A. E., Gao, X., Iten, L. E., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+pattern+formation+in+the+inner+ear:+do+compartment+boundaries+play+a+role.">Molecular genetics of pattern formation in the inner ear: do compartment boundaries play a role.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 11700-11706 (1073).</li><li>Bellairs, R., Osmond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The atlas of chick development. , (2005).</li><li>Manley, G. A., Haeseler, C., Brix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+patterns+and+spontaneous+activity+of+afferent+fibres+to+the+lagenar+macula+and+apical+basilar+papilla+of+the+chick's+cochlea.">Innervation patterns and spontaneous activity of afferent fibres to the lagenar macula and apical basilar papilla of the chick's cochlea.</a> Hearing Research. 56, 211-226 (1991).</li><li>Code, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efferent+neurons+to+the+macular+lagena+in+the+embryonic+chick.">Efferent neurons to the macular lagena in the embryonic chick.</a> Hearing Research. 82, 26-30 (1995).</li><li>Maklad, A., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+vestibular+afferent+projections+into+the+hindbrain+and+their+central+targets.">Development of vestibular afferent projections into the hindbrain and their central targets.</a> Brain Research Bulletin. 60, 497-510 (2003).</li><li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+system+development:+primary+auditory+neurons+and+their+targets.">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li><li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+inner+ear+cells+using+genomic+tags+for+clonal+identification.">Lineage analysis of inner ear cells using genomic tags for clonal identification.</a> Methods Mol. Biol. 493, 47-63 (2009).</li><li>Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+morphogenesis+of+the+vertebrate+inner+ear.">Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 521-533 (2007).</li><li>Appler, J. M., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+the+ear+to+the+brain:+Molecular+mechanisms+of+auditory+circuit+assembly.">Connecting the ear to the brain: Molecular mechanisms of auditory circuit assembly.</a> Progress in Neurobiology. 93, 488-508 (2011).</li><li>Bulankina, A. V., Moser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+circuit+development+in+the+mammalian+cochlea.">Neural circuit development in the mammalian cochlea.</a> Physiology (Bethesda). 27, 100-112 (2012).</li><li>Fekete, D. M., Campero, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+inner+ear.">Axon guidance in the inner ear.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51, 549-556 (2007).</li><li>Momose-Sato, Y., Glover, J. C., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+functional+synaptic+connections+in+the+auditory+system+visualized+with+optical+recording:+afferent-evoked+activity+is+present+from+early+stages.">Development of functional synaptic connections in the auditory system visualized with optical recording: afferent-evoked activity is present from early stages.</a> Journal of Neurophysiology. 96, 1949-1962 (2006).</li><li>Marrs, G. S., Spirou, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+assembly+of+auditory+circuits:+spiral+ganglion+and+brainstem.">Embryonic assembly of auditory circuits: spiral ganglion and brainstem.</a> The Journal of Physiology. 590, 2391-2408 (2012).</li><li>Milo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+the+function+of+the+transcription+factor+gata3+during+development+of+the+mammalian+inner+ear.">Genomic analysis of the function of the transcription factor gata3 during development of the mammalian inner ear.</a> PloS One. 4, e7144 (2009).</li><li>Fritzsch, B., Eberl, D. F., Beisel, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bHLH+genes+in+ear+development+and+evolution:+revisiting+a+10-year-old+hypothesis.">The role of bHLH genes in ear development and evolution: revisiting a 10-year-old hypothesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67, 3089-3099 (2010).</li><li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurod1+regulates+survival+and+formation+of+connections+in+mouse+ear+and+brain.">Neurod1 regulates survival and formation of connections in mouse ear and brain.</a> Cell and Tissue Research. 341, 95-110 (2010).</li><li>Huang, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brn3a+is+a+transcriptional+regulator+of+soma+size,+target+field+innervation+and+axon+pathfinding+of+inner+ear+sensory+neurons.">Brn3a is a transcriptional regulator of soma size, target field innervation and axon pathfinding of inner ear sensory neurons.</a> Development. 128, 2421-2432 (2001).</li><li>Jones, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Gata3+transcription+factor+in+the+acoustic+ganglion+of+the+developing+avian+inner+ear.">Expression of the Gata3 transcription factor in the acoustic ganglion of the developing avian inner ear.</a> The Journal of Comparative Neurology. 516, 507-518 (2009).</li><li>Lu, C. C., Appler, J. M., Houseman, E. A., Goodrich, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+profiling+of+spiral+ganglion+neurons+reveals+insights+into+auditory+circuit+assembly.">Developmental profiling of spiral ganglion neurons reveals insights into auditory circuit assembly.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 10903-10918 (2011).</li></ol>

والإعلان عن أي تضارب في المصالح.

واقتصرت دراسات التنمية في وقت مبكر من العصب VIIIth ويرجع ذلك جزئيا لصعوبة في تحديد محاور عصبية الجنينية الناجمة عن العقد متميزة متعددة. واستكشفت عدة دراسات الإشارات الجزيئية والخلايا السمعية توجيه الحسية الدهليزي ومصائر خلية العقدة خلال التنمية في وقت مبكر، ولكن 5،...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> البوليسترين زن صحن </td><td> فيشر العلمية </td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td> طبق بتري، 35 X 10 مم </td><td> فيشر العلمية </td><td> 50820644 </td><td> استخدام السيليكون لجعل الطبق تشريح </td></tr><tr><td> Sylgard كيت سيليكون إلاستومر </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td> SYLG184 </td><td> معطف بيتري لجعل الطبق تشريح </td></tr><tr><td> تشريح دبابيس </td><td> مختلف </td><td></td><td> يحمل الجنين في أثناء تشريح </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> مختلف </td><td></td><td> جزء من وصفة ACSF </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> مختلف </td><td></td><td> جزء من وصفة ACSF </TD&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> مختلف </td><td></td><td> جزء من وصفة ACSF </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> مختلف </td><td></td><td> جزء من وصفة ACSF </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> مختلف </td><td></td><td> جزء من وصفة ACSF </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> مختلف </td><td></td><td> جزء من وصفة ACSF </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> مختلف </td><td></td><td> جزء من وصفة ACSF </td></tr><tr><td> حاوية لACSF. تشير شفافة واسعة الفم Nalgene جرة، 500 مل (16 أوقية) مع غطاء. </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td> حفر ثقب في افتتاح قمة غطاء للزجاج bubling الجذعية لاختراق السائل </td></tr><tr><td> الزجاج فارغة أو 5 مل قارورة قارورة شفافة قابلة للمقارنة </td><td> أمريكا الدوائية الشركاء، وشركة </td><td> 6332300105 </td><tد&gt; استخدم خلال الحضانة للحفاظ على عينات ACSF منفصلة عن بعضها البعض وعن تيار محتدما </td></tr><tr><td> خزان كربوجين (95٪ O 2/5٪ CO 2) متصلة بواسطة أنابيب إلى عوامات </td><td> مختلف </td><td></td><td> بواسطة أنابيب لإرفاق عوامات الجذعية الزجاج للتسريب في ACSF </td></tr><tr><td> الزجاج الجذعية الفوار </td><td> مختلف </td><td></td><td> للبث في كربوجين ACSF </td></tr><tr><td> منحني ملقط غيض </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td> 501008 </td><td> لإزالة الجنين من بويضة رئيس </td></tr><tr><td> اثنين غرامة ملقط غيض </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td> 501985 </td><td> لتشريح الصغيرة </td></tr><tr><td> 50 مل بيكر </td><td> مختلف </td><td></td><td></td></tr><tr><td> رودامين دكستران أمين (RDA) </td><td> إينفيتروجن </td><td> مختلف </td><td> الفلورسنت محور عصبي التتبع </td></tr><tr><td> تريتون X-100 </td><td> Biomedicals ICN </td><td></td><td></td></tr><tr><td> التخزين المؤقت المالحة الفوسفات، (1X PBS) </td><td> مختلف </td><td></td><td> معيار مختبر كاشف </td></tr><tr><td> رقيقة الجدار الزجاجي الأوعية الشعرية، 1.2 OD، .9 ID 4 &quot;(100 مم) طول </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td> TW120F-4 </td><td> تحميل مع RDA. كل شعري يجعل micropipettes الزجاج اثنين </td></tr><tr><td> إبرة / الماصة مجتذب </td><td> ديفيد KOPF الصكوك </td><td> نموذج 720 </td><td> الإعدادات المستخدمة: الحرارة 16.4، 2.2 الملف اللولبي </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td> باركر الأجهزة </td><td> مختلف </td><td> بواسطة أنابيب إرفاق غرامة لmicropipette الزجاج </td></tr><tr><td> مياداة مجهرية </td><td> Narishige </td><td> مختلف </td><td></td></tr><tr><td> المجهر تشريح مع مضان </td><td> مختلف </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> 4٪ لامتصاص العرق </td><td> مختلف </td><td></td><td> معيار مختبر كاشف </td></tr><tr><td> المضادة للأجسام المضادة خيط عصبي، اختياري </td><td> ميليبور </td><td> AB1991 </td><td> اتبع بروتوكول النسيجية موصى بها من قبل الشركة المصنعة </td></tr><tr><td> ناظم البرد والمواد المرتبطة بها لتقطيع </td><td> لايكا </td><td> مختلف </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescent المجهر للتصوير </td><td> زايس، ومختلف </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

selective tracing of auditory fibers in the avian embryonic vestibulocochlear nerve

فرخ الجنينية هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لدراسة الطرفية والمركزية التوقعات خلية العقدة. في الجهاز السمعي، ووضع العلامات الانتقائي للمحاور عصبية السمعية داخل العصب القحفي VIIIth تعزيز دراسة السمعية المركزية التنمية الدائرة. هذا النهج من الأمور الصعبة نظرا الحواس متعددة من الأذن الداخلية والعصب المساهمة في VIIIth 1. وعلاوة على ذلك، علامات التي تميز بشكل موثوق السمعية مقابل مجموعة من المحاور العصبية الدهليزي داخل العصب VIIIth الطيور لا يزال يتعين تحديدها. لا يمكن السمعية والدهليزية مسارات يمكن تمييزها وظيفيا في الأجنة في وقت مبكر، كما الحسية استجابات ليست موجودة قبل تشكيل الدوائر. وقد تتبعت إسقاط مركزيا بالخلايا العصبية VIIIth في بعض الدراسات، ولكن رافق السمعية محور عصبي وضع العلامات من قبل المكونات الأخرى من وضع العلامات العصبية VIIIth 2،3. هنا، نحن تصف طريقة لتتبع تقدمي من العقدة الصوتية لابي انتقائيمحاور عصبية ل السمعية داخل العصب VIIIth النامية. الأولى، بعد تشريح جزء من المنطقة الأمامية من الرأس الجنين الفرخ يوم 8-منغمسين في الاوكسيجين السائل النخاعي الاصطناعي، تم تحديد قناة القوقعية من المعالم التشريحية. المقبل، يتم وضع غرامة micropipette الزجاج سحبت لحقن كمية صغيرة من الأمينات رودامين ديكستران في المنطقة العميقة لاصق والمجاورة حيث توجد خلايا العقدة الصوتية. في غضون ثلاثين دقيقة بعد الحقن، وتتبع محاور عصبية السمعي في الدماغ المؤخر مركزيا ويمكن أن تكون في وقت لاحق بعد إعداد تصور نسيجية. هذا الأسلوب يوفر أداة مفيدة للدراسات الإنمائية من الطرفية إلى وسط السمعية تشكيل الدائرة.

مكونات العصب VIIIth وتشريح الأعصاب نفسها معقدة ومعقدة (أرقام 1، 3). عن طريق تتبع انتقائي الألياف الناشئة عن خلايا العقدة الصوتية، يمكن شرائح العصب VIIIth وكذلك afferents السمعية الأولية في الدماغ تتبع نظيفة وتمييزها عن نظيراتها الدهليزي (أرقام 2، 3). وبالمثل، ي?...

Watch this Scientific Journal Video about Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve at JoVE.com

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

نحن هنا وصف تقنية تسليخ مجهري تليها حقن صبغة الفلورسنت في العقدة الصوتية للأجنة الكتكوت المبكر للانتقائية تتبع من ألياف المحور العصبي السمعي في الدماغ المؤخر والعصب.

انتقائية للبحث عن المفقودين من ألياف العصب السمعي في الطيور الدهليزي القوقعي الجنينية

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

selective-tracing-auditory-fibers-avian-embryonic-vestibulocochlear

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.1K Views.  University of California, Irvine. نحن هنا وصف تقنية تسليخ مجهري تليها حقن صبغة الفلورسنت في العقدة الصوتية للأجنة الكتكوت المبكر للانتقائية تتبع من ألياف المحور العصبي السمعي في الدماغ المؤخر والعصب.

Video: Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Developmental Biology

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

بعد المشبكي التسجيلات في وارد الاتصال الانشعابيات القوقعة خلايا الشعر الداخلية : رصد النسخة عديد الحويصلات في الشريط المشبك

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at discreet periods of development 1-4 as well as mechanisms for temporal coding in the central nervous system 5-7.
Here we present a method to prepare chicken auditory brainstem slices that can be used for acute experimental procedures or to culture organotypic slices for long-term experimental manipulations.
The chicken auditory brainstem is composed of nucleus angularis, magnocellularis, laminaris and superior olive. These nuclei are responsible for binaural sound processing and single coronal slice preparations preserve the entire circuitry. Ultimately, organotypic slice cultures can provide the opportunity to manipulate several developmental parameters such as synaptic activity, expression of pre and postsynaptic components, expression of aspects controlling excitability and differential gene expression
This approach can be used to broaden general knowledge about neural circuit development, refinement and maturation.

The chicken auditory brainstem is comprised of nuclei responsible for binaural sound processing. A single coronal slice preparation maintains the entire circuitry while the cultured approach provides a unique preparation to study the development of neuronal structure and auditory function at the molecular, cellular and network levels.

إعداد وثقافة شرائح الدجاج الدماغ السمعية

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها<em&gt; في البيضة</em&gt; الصغرى Electroporation لل

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

في أوفو إليكتروبوراتيون في الدماغ الدماغ السمعي

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

في طرق Ovo و Ex Ovo لدراسة تطور الأذن الداخلية للطيور

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology differentially oriented along a tonotopic (i.e., frequency) axis. The tonotopic axis permits the segregated encoding of high-frequency sounds in the rostral-medial plane and low-frequency encoding in caudo-lateral regions. Traditionally, coronal brainstem slices of embryonic tissue permit the study of relative individual iso-frequency lamina. Although sufficient to investigate anatomical and physiological questions pertaining to individual iso-frequency regions, the study of tonotopic variation and its development across larger auditory brainstem areas is somewhat limited. This protocol reports brainstem slicing techniques from chicken embryos that encompass larger gradients of frequency regions in the lower auditory brainstem. The utilization of different slicing methods for chicken auditory brainstem tissue permits electrophysiological and anatomical experiments within one brainstem slice, where larger gradients of tonotopic properties and developmental trajectories are better preserved than coronal sections. Multiple slicing techniques allow for improved investigation of the diverse anatomical, biophysical, and tonotopic properties of auditory brainstem microcircuits.

Here we present a protocol for obtaining non-coronal auditory brainstem slices of the chicken embryo for the investigation of tonotopic properties and developmental trajectories within one brainstem slice. These slices include sagittal, horizontal, and horizontal/transverse sections encompassing larger tonotopic regions within an individual slice plane that the traditional coronal sections.

تقطيع جذع دماغ الدجاج السمعي الجنيني لتقييم التدرجات التونية والدوائر الدقيقة

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology ...

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ABRs in measuring auditory neural synchrony and estimating hearing sensitivity in other vertebrate model systems, methods for recording ABRs in the chicken have not been reported in nearly four decades. Chickens provide a robust animal research model because their auditory system is near functional maturation during late embryonic and early hatchling stages. We have demonstrated methods used to elicit one or two-channel ABR recordings using subdermal needle electrode arrays in chicken hatchlings. Regardless of electrode recording configuration (i.e., montage), ABR recordings included 3-4 positive-going peak waveforms within the first 6 ms of a suprathreshold click stimulus. Peak-to-trough waveform amplitudes ranged from 2-11 &#181;V at high-intensity levels, with positive peaks exhibiting expected latency-intensity functions (i.e., increase in latency as a function of decreased intensity). Standardized earphone position was critical for optimal recordings as loose skin can occlude the ear canal, and animal movement can dislodge the stimulus transducer. Peak amplitudes were smaller, and latencies were longer as animal body temperature lowered, supporting the need for maintaining physiological body temperature. For young hatchlings (&#60;3 h post-hatch day 1), thresholds were elevated by ~5 dB, peak latencies increased ~1-2 ms, and peak to trough amplitudes were decreased ~1 &#181;V compared to older hatchlings. This suggests a potential conductive-related issue (i.e., fluid in the middle ear cavity) and should be considered for young hatchlings. Overall, the ABR methods outlined here permit accurate and reproducible recording of in-vivo auditory function in chicken hatchlings that could be applied to different stages of development. Such findings are easily compared to human and mammalian models of hearing loss, aging, or other auditory-related manipulations.

We have used standard auditory brainstem response (ABR) techniques and applied them to hatchling chickens, a precocious avian model for auditory function. The protocol outlines animal preparation and ABR acquisition techniques in detail, with steps that could translate to other avian or rodent models.

تقييم استجابة جذع الدماغ السمعي في فراخ الدجاج

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to aberrant neuronal and synaptic activities in fragile X syndrome (FXS), which is characterized by intellectual disability, sensory abnormalities, and social communication problems. Studies of FMRP function and FXS pathogenesis have primarily been conducted with Fmr1 (the gene encoding FMRP) knockout in transgenic animals. Here we report an in vivo method for determining the cell-autonomous function of FMRP during the period of circuit assembly and synaptic formation using chicken embryos. This method employs stage-, site-, and direction-specific electroporation of a drug-inducible vector system containing Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) and an EGFP reporter. With this method, we achieved selective FMRP knockdown in the auditory ganglion (AG) and in one of its brainstem targets, the nucleus magnocellularis (NM), thus providing a component-specific manipulation within the AG-NM circuit. Additionally, the mosaic pattern of the transfection allows within-animal controls and neighboring neuron/fiber comparisons for enhanced reliability and sensitivity in data analyzing. The inducible vector system provides temporal control of gene editing onset to minimize accumulating developmental effects. The combination of these strategies provides an innovative tool to dissect the cell-autonomous function of FMRP in synaptic and circuit development.

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Using in ovo electroporation, we devised a method to selectively transfect the auditory inner ear and cochlear nucleus in chicken embryos to achieve a cell-group-specific knockdown of fragile X mental retardation protein during discrete periods of circuit assembly.

تشريح وظيفة الخلية المستقلة لبروتين التخلف العقلي X الهش في دائرة سمعية بواسطة التثقيب الكهربائي في Ovo

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter receptors that contribute to cell diversity across this population. This protocol outlines the steps necessary for successful dissecting, dissociating, and short-term culturing of the somata of inner ear bipolar neurons for the purpose of patch-clamp recordings. Detailed instructions for preparing vestibular ganglion neurons are provided with the necessary modifications needed for plating spiral ganglion neurons. The protocol includes instructions for performing whole-cell patch-clamp recordings in the perforated-patch configuration. Example results characterizing the voltage-clamp recordings of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN)-mediated currents highlight the stability of perforated-patch recording configuration in comparison to the more standard ruptured-patch configuration. The combination of these methods, isolated somata plus perforated-patch-clamp recordings, can be used to study cellular processes that require long, stable recordings and the preservation of intracellular milieu, such as signaling through G-protein coupled receptors.

Presented here are methods providing detailed instructions for dissecting, dissociating, culturing, and patch-clamp recording from vestibular ganglion and spiral ganglion neurons of the inner ear.

عزل وزراعة العقدة الدهليزية والحلزونية من القوارض الوليدية لتسجيلات المشبك الرقعي

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...